FST和FSTL3在绵羊季节性发情启动中的作用及机制研究

Most of Sheep are seasonal breeders, and the breeding season begins at the end of summer or the beginning of autumn. Recently FST and FSTL3 were reported to be associated with animal reproductive activities. Overexpression FST and FSTL3 would inhibt gonadal activity. they might be related to estrus onset or inhibition. However the underlying mechanism is unclear. In the present study, the effect and molecular mechanism of FST and FSTL3 on the onset of Tan sheep seasonal estrus will be elucidated. The expression change of the FST, FSTL3 and avtivin in ovary of the anestrus, proestrus, estrus and diestrus stages of sheep will be analyzed by real-time PCR and Western blot. The location of the genes will be analyzed by multiple immunofluorescence labeling. The RNAi will be performed to analyze the effects of FST or FSTL3 deletion on cell differentiation, hormone level and expression level. The association between FST and FSTL3 will also be explored,and the relationship between FST/FSTL3 expression and reproductive stage, hormone level and follicular development will be determined. The role and molecular mechanism of FST and FSTL3 in the onset of seasonal estrus will be predicted according to the results in above. The results will be meaningfulfor revealing the molecular mechanism of onset of sheep seasonal estrus.

大多数绵羊属于季节性繁殖动物，在日照逐渐缩短的夏末秋初开始发情。有研究报道FST和FSTL3基因影响雌性动物的繁殖，其过表达会抑制性腺活动，推测可能与发情的启动或抑制有关，但具体作用机制尚不清楚。本项目以滩羊为研究对象，拟利用实时荧光定量PCR和Western blot技术，分析绵羊不同繁殖状态下（乏情期、发情前期、发情期和发情间期），FST和FSTL3基因在卵巢中mRNA与蛋白质表达量的变化规律；采用多重免疫荧光标记技术分析蛋白表达位置的变化；采用RNAi技术研究FST/FSTL3基因缺失后，对绵羊卵巢颗粒细胞分化、激素水平、基因表达量的影响，以及FST和FSTL3相互之间的影响；分析FST和FSTL3基因表达量与绵羊繁殖状态、激素水平、卵泡发育的关系。综合上述结果，解析FST和FSTL3基因在绵羊季节性发情启动中的功能及作用机制，研究结果对于了解动物季节性发情的启动机制具有重要意义。

大多数绵羊属于季节性繁殖动物，在日照逐渐缩短的夏末秋初开始发情。有研究报道FST和FSTL3基因影响雌性动物的繁殖，其过表达会抑制性腺活动，推测可能与发情的启动或抑制有关，但具体作用机制尚不清楚。本项目以季节性发情的敖汉细毛羊为研究对象，利用实时荧光定量PCR、western blot、多重免疫荧光标记和RNAi等技术，探索了FST 和 FSTL3 基因对季节性发情启动的调控机制。结果显示，FST 和 FSTL3 基因在各时期卵泡中均有表达，主要表达于卵巢颗粒细胞中。在发情的不同时期，FST和FSTL3基因之间互相协同调节卵巢的变化。在乏情季节表达量均比发情季节低。在发情季节的不同周期中 FST和 FSTL3 基因在发情间期和发情前期高表达，发情间期最高，发情期最低。在发情间期 P4的分泌水平最高，E2在发情间期最低，在发情前期和发情期较高，FSH在发情间期和发情前期显著低于发情期。因此推测，FST 和 FSTL3 基因在发情间期和发情前期的高表达促进P4的分泌，抑制FSH和 E2 的分泌。对原代培养的绵羊卵巢颗粒细胞进行FSHR免疫荧光染色，结果显示培养的细胞纯度较高，FSHR阳性率达95%以上。设计FSTL3基因的siRNA干扰载体，转染细胞后干扰效率可达85.84%，同时利用western blot、免疫荧光分析，干扰组的FSTL3蛋白表达量显著降低。通过RNAi方法对FSTL3干扰后48h进行E2 和P4浓度进行测定发现，FSTL3基因被抑制后E2含量显著增加，P4含量显著降低。证明FSTL3基因对卵巢颗粒细胞分泌E2具有负调控作用，对P4具有正调控作用。综上分析，FST和 FSTL3 基因有可能是通过协同调节 E2 和 P4 的分泌量对季节性发情的启动以及发情状态的维持进行调控。在实际育种工作中，可以考虑通过敲除FST和 FSTL3 基因，来开启和维持绵羊的发情。