HPV E6/E7通过RNA甲基转移酶METTL3调控长链非编码RNA lnc-CCDST的m6A修饰介导宫颈癌发病的分子机制研究

Cervical cancer is the commonest female-specific disease with a high incidence and mortality in developing countries. Although HPV vaccine and pap screening have reduced mortality rates, metastasis still results in poor survival and prognosis in cervical cancer patients. The role of long non-coding RNAs in cervical cancer pathogenesis remains elusive, although the mechanism of HPV induced cervical cancer are well studied. Recently, we identified a novel decreased lncRNA lnc-CCDST, which can significantly inhibit cell motility and angiogenesis by interacting and degrading DHX9 (Cell Death Differ，2018). In this project, we hypothesize that lnc-CCDST may be regulated by HPV E6/E7 through lnc-CCDST m6A modification. To address this hypothesis, we will detect the lnc-CCDST m6A modification and their (de)methyltransferases; investigate the potential mechanism of how HPV E6/E7 affect lnc-CCDST m6A modification through regulating (de)methyltransferases. Defining the mechanism of HPV E6/E7 induced lnc-CCDST m6A modification is the key significance of our project. It is promising to develop new targets for cervical cancer diagnosis and treatment.

宫颈癌恶性程度高，且近年来发病呈低龄化。疫苗及早期筛查可以降低宫颈癌的发病率，然而并未广泛普及。宫颈癌中长链非编码RNA是否存在m6A修饰尚不清楚。申请人近来的研究发现，HPV E6/E7下调的lnc-CCDST可以促进MDM2结合并泛素化降解DHX9影响宫颈癌转移与血管生成（Cell Death Differ，2018），然而E6/E7如何调控lnc-CCDST的表达目前并不清楚。我们近期的预实验发现，甲基化转移酶METTL3可以调节lnc-CCDST的m6A修饰，为此我们提出科学假说：E6/E7可能通过调控METTL3表达影响了lnc-CCDST m6A修饰，从而参与宫颈癌的发病。本项目拟：（1）鉴定METTL3调控lnc-CCDST m6A修饰的分子机制；（2）探索E6/E7调控METTL3表达的机制。本项目的实施有望为宫颈癌的早期诊疗提供潜在的分子靶点。

宫颈癌是全球女性中第二常见的癌症，而高危型HPV感染在其发展中起着关键作用。尽管由于HPV疫苗的应用和早期诊断方法的建立，发达国家宫颈癌的发病率开始下降，但宫颈癌及其远处转移仍然严重威胁着发展中国家妇女的生命。因此，本研究旨在阐明宫颈癌发生的潜在机制。方法：免疫组织化学验证NSUN2在宫颈癌组织中的表达水平；ArraystarTMSmall RNA Modification (m5C) Array寻找NSUN2调控的m5C修饰的miRNA。通过miRNAs微阵列分析探讨三对宫颈癌组织中miRNA表达的差异。进行RT-qPCR 和荧光原位杂交（FISH）以确认候选miRNA的异常表达，而随后进行Transwell迁移和Matrigel侵袭测定以表明其在宫颈癌转移中的作用。通过基因芯片、荧光素酶检测、Western blot和突变检测，筛选并验证了候选miRNA靶点，进一步证明了其在宫颈癌细胞迁移和侵袭过程中的差异表达水平和功能。通过siRNA进行的蛋白质印迹和基因沉默被用来说明该过程中的关键信号通路和HPV癌基因。结果：首先，NSUN2在宫颈癌组织中高表达，并催化miR-134-3p发生m5C修饰。在宫颈癌组织中和HPV阳性癌细胞中发现miR-134-3p的表达下调，而miR-134-3p的过表达阻碍了宫颈癌细胞的迁移和侵袭。进一步鉴定了KLHDC7B，以及其在宫颈癌组织和HPV阳性细胞中的表达水平增加。在HPV阳性的宫颈癌细胞中敲低KLHDC7B 可显着消除细胞迁移和侵袭。此外，miR-134-3p/KLHDC7B轴调节STAT3、AKT和p38信号通路的活性，而HPV E6和E7蛋白可能与该过程有关。