肺癌中端粒酶关键组分卡扎尔体蛋白1在端粒调控中的作用机制研究

端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase Cajal body protein 1，TCAB1)是2009年最新发现的一种新的端粒酶亚基，它的发现有可能为研究肺癌的发生发展机制开辟一个新的途径。本课题通过前期试验发现TCAB1在人类肺腺癌组织和细胞株均表达阳性，因此本课题申请旨在通过利用RNAi等技术干扰肺腺癌细胞中TCAB1基因的表达，观察其对端粒酶活性、端粒与端粒酶结合力、端粒长度及细胞增殖的影响。 2）利用免疫共沉淀和蛋白质质谱等技术确定在细胞S期介导TCAB1与端粒结合的目标蛋白并初步阐明TCAB1的作用机制。通过上述探索性研究，将有助于阐明TCAB1调控肺癌的发生机制并为肺癌的防治提供分子靶标。

TCAB1是2009年新发现的端粒酶亚基，课题组前期实验发现TCAB1在肺癌组织和细胞株中均表达阳性，推测其在肺癌的发生发展过程中具有重要作用。在项目实施过程中，我们采用RNAi技术靶向抑制TCAB1的表达，发现人端粒酶逆转录酶（hTERT）与端粒标记蛋白TRF2共定位显著减少，但端粒长度并没有明显变化；TCAB1表达抑制的肺癌细胞增殖能力显著下降，处于G1期的细胞比率显著上升，周期蛋白依赖性激酶CDK6的表达下降；提示沉默TCAB1的表达抑制A549细胞中端粒酶与端粒的结合，通过下调CDK6的表达诱导细胞G1/S期阻滞抑制细胞的增殖。课题组采用双胸苷阻断法获得同步化于S期的肺癌细胞，免疫共沉淀耦联LC/MS鉴定与TCAB1相互作用的蛋白质，选取评分较高的RUVBL1、HSPA2和EEF1A2进行后续研究。我们发现，RUVBL1在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，RNAi技术抑制RUVBL1的表达未对端粒长度造成明显的影响；MRN复合体、DNA损伤及DNA双链损伤修复通路蛋白的表达水平未发生明显改变；RUVBL1表达抑制的A549细胞的增殖能力显著下降；诱导细胞G1/S期阻滞，与之相关的Akt/GSK3β/cyclin D1通路失活，c-myc表达下降；GSK3β抑制剂预处理RUVBL1表达抑制的细胞其周期阻滞获得部分回复；提示沉默RUVBL1的表达诱导细胞G1/S期阻滞，与抑制Akt/GSK3β/cyclin D1通路相关。抑制HSPA2的表达未显著缩短端粒长度，但抑制肺癌细胞的增殖，诱导细胞G1/S期阻滞；cyclin D3和CDK4表达下降，周期抑制蛋白p21表达显著上调；同时观察到HSPA2表达抑制的细胞存在内质网应激（ERS）的现象；提示抑制HSPA2的表达诱导细胞G1/S期阻滞，与下调cyclin D3、CDK4的表达和引起ERS相关。抑制EEF1A2的表达未对端粒长度造成影响，但抑制肺癌细胞的增殖和侵袭转移。综上所述，靶向抑制TCAB1及与其互作的RUVBL1、HSPA2和EEF1A2均显著抑制肺癌细胞的增殖，但未显著缩短端粒长度。端粒长度发生变化需要一定代数的细胞分裂，因每次分裂端粒长度仅损失50~200bp，可能是本研究未观察到抑制目的基因的表达端粒长度缩短的原因之一。本项目的研究为阐明TCAB1在肺癌中的作用机制提供了详实的实验证据。