嗜热古菌Pyrococcus furiosus DNA聚合酶的生化性质及校读机制

A DNA polymerase from the hyperthermophilic archaea Pyrococcus furiosus isolated from marine sediments, is a model enzyme for studying archaeal DNA polymerases. Previous studies of this project aligned the amino acid residues of B family DNA polymerases, and studied that Pfu DNA polymerase bound to DNA at high temperature. Based on the current results, this project will engineer Pfu DNA polymerase mutants including amino acid substitutions, β-hairpin deletion, and the Pfu/T4 β-hairpin chimera by using molecular biology technology. The polymerase activity and exonuclease activity, and the mode of binding to DNA of Pfu DNA polymerase and its mutants at high temperature will be characterized by primer extension method, primer degradation method, electrophoretic mobility shift assays, fluorescence analysis, and pre-steady state kinetic methods. The aim of this project is to clarify the regulation mechanism between the polymerase activity and the exonuclease activity of archaeal DNA polymerases, the high fidelity mechanism and proofreading mechanism of archaeal DNA polymerases at high temperature. The research findings of this project will not only reveal DNA replication mechanism of archaea that live at high temperature, but also reveal that DNA polymerases from different organisms are capable of replicating DNA under different environment, thus helping us understand the extreme feature of life and environmental adaptation mechanism.

海洋沉积物中的嗜热古菌Pyrococcus furiosus DNA聚合酶是研究古菌DNA聚合酶的模式酶。本项目的前期工作对B家族DNA聚合酶的氨基酸序列进行了比对，并初步研究了Pfu DNA聚合酶高温条件下结合DNA。在此基础上，本项目拟利用分子生物学技术，构建Pfu DNA聚合酶突变体，包括氨基酸取代突变体、β-hairpin缺失突变体和Pfu/T4β-hairpin嵌合体。采用引物延伸法、引物降解法、凝胶阻滞实验、荧光分析和预稳态动力学技术研究Pfu DNA聚合酶及其突变体高温条件下的聚合活性、外切活性和结合DNA的模式。研究的目的是阐明古菌DNA聚合酶高温条件下聚合活性和外切活性的调控机制、高保真的机制和校读活性机制。项目的研究成果不仅能揭示高温古菌的复制DNA机理，而且还能揭示来源不同的B家族DNA聚合酶能够在不同环境中复制DNA的机理，有助于我们认知极端生命特征和环境适应机理。

DNA聚合酶是DNA复制、DNA修复和DNA重组过程中的核心酶，参与了DNA测序、扩增、定点突变、标记等反应，在分子生物学领域具有广泛的应用。本项目构建了一系列对聚合活性和外切活性具有潜在影响的Pfu DNA聚合酶突变体，纯化了部分突变体蛋白，初步研究了Pfu DNA聚合酶突变体的PCR扩增效率。研究发现，L409，I540，G544是影响Pfu DNA聚合酶聚合活性的重要氨基酸残基，并推测 G155、T208、A408、Q462和K508是影响Pfu DNA聚合酶聚合活性和外切活性平衡的关键氨基酸残基。本项目综述了极端嗜热古菌DNA聚合酶在生物技术领域中的应用。此外，本项目构建了药物敏感型T4噬菌体DNA聚合酶突变体G466S、G466S/Y460F和V475W，分析了其突变频率。研究结果表明，G466S/Y460F T4噬菌体具有与单疱疹病毒DNA聚合酶相似的药物敏感性。项目成果首次揭示了T4噬菌体DNA聚合酶和单疱疹病毒DNA聚合酶分别对药物抗性和敏感性的分子机制，为筛选抗单疱疹病毒药物提供重要的靶标。本项目关于DNA聚合酶的研究成果有助于我们进一步认知DNA聚合酶的功能。.源自中温噬菌体HNH核酸内切切刻DNA，在噬菌体生活周期中起着非常重要的作用。但是，关于嗜热噬菌体HNH核酸内切酶的研究，尚未报道。本项目首次开展了深海嗜热噬菌体GVE2 HNH的核酸内切酶生化性质和晶体结构的研究。研究发现，GVE2 HNH核酸内切酶切割DNA的最适温度在60-65℃，最适pH为8.0-9.0。GVE2 HNH核酸内切酶切割DNA依赖于二价金属离子，Mn2+存在时，该酶切割DNA的效率最高。本项目解析了GVE2 HNH核酸内切酶的晶体结构， H93、N109和H118组成了该酶的活性中心。进一步研究发现，H93A、N109A和H118A的氨基酸取代分别引起了GVE2 HNH核酸内切酶活性损失96%、86%和66%。上述研究成果为揭示GVE2 HNH核酸内切酶在噬菌体GVE2生活周期所起的作用提供了理论依据。.此外，本项目利用高通量测序技术首次研究了西南印度洋深海沉积物的细菌、古菌和真菌的群落组成，为推动该环境中深海微生物资源的开发提供了重要的参考。.本项目已发表论文7篇，其中SCI收录5篇，申请相关专利1个，完成了项目任务书中的研究目标。.