基于涨落信号提取技术提高活细胞SOFI超分辨显微时间分辨率

The development of modern biological and medical researches require the observation of the dynamic process of sub-cellular structure in the living cell. And these researches require high temporal and spatial resolution of the research tool. For now, far-field super-resolution optical microscopy is the major tool for the observation on living cell structure. However, the existing techniques still have issues as low temporal resolution, high illumination intensity, high complexity of the system and so on. SOFI has great features as low illumination intensity, simplified imaging system and so on, but the temporal resolution is as low as several seconds to tens of seconds. And the low temporal resolution of SOFI could restrict its applications in the field of living cell researches. In this project, we propose a SOFI algorithm with an enhanced temporal resolution, which could be used to observe the dynamic structure of a living cell. First, the influence of issues, such as the stability of fluorescence protein, on the performance of the SOFI algorithm will be studied. Based on these research, the SOFI theory will be modified. Then the calculation efficiency of SOFI will be improved by the fluctuation signal extraction process based on digital signal processing technologies. The performance of modified SOFI algorithm will be researched with different microscopy platforms. Finally, this project will realise SOFI microscopy with the temporal resolution of 1 s and lateral resolution of 100 nm, when examining living cell labelled with common fluorescent proteins as GFP and Dronpa. This project will realise a super-resolution microscopy with high temporal resolution, which is a novel research tool for living cell research.

现代生物医学亟需实现对活细胞结构的动态过程进行检测，对研究工具的时间空间分辨率提出了较高的要求。目前，远场光学超分辨显微技术是研究活细胞动态过程的主要研究工具，但大多存在时间分辨率差、照明光强高、设备复杂等问题。光学涨落超分辨显微(SOFI)同时具备低照明强度，设备简单等优点。但SOFI的时间分辨率都在几秒至几十秒，难以实现活细胞结构的显微成像。本项目，提出一种适用于活细胞的具有较高时间分辨率的SOFI超分辨显微技术。首先研究荧光蛋白亮度不稳定性等因素对SOFI算法的影响，并对传统SOFI理论模型进行改进。在此基础上利用数字信号处理技术提高涨落信号的提取效率，建立效率更高的SOFI算法。研究不同显微平台对SOFI时间分辨率的影响。最终，在对GFP和Dronpa荧光蛋白标记的活细胞样本进行显微成像时，实现1s的时间分辨率和100nm的空间分辨率，进而为活细胞研究提供新的工具。

本项目的目的是在活细胞中实现快速 SOFI 超分辨率显微成像。现有的几种超分辨成像，包括SOFI超分辨显微在内，在高标记密度区域的图像结果中，分辨图像中细胞器结构的连续性较差、时间分辨率较低，严重限制了超分辨显微在活细胞研究中的应用。本课题首先对传统SOFI模型的基础理论缺陷进行了深入研究，发现传统理论没有考虑不同荧光标记的波动信号的时空混叠，导致传统SOFI无法实现精确观察活细胞动态过程。.针对这一问题，本课题组采用多种数字信号处理方法研究了波动信号提取的全过程，实现了一种新的SOFI超分辨显微技术。首先，分析了不同波动信号提取方法对SOFI时间分辨率的影响，得出了波动信号的最佳时空去混叠方法和参数设置。当使用固定生物细胞样本进行实验时，可以使用10张原始图像重建超分辨率图像效果与100张相近，充分说明新型SOFI的重建效率得到了显着提升。.在新的SOFI活细胞超分辨实验中，通过分析不同SOFI算法设置下的处理结果，得出检测荧光蛋白EGFP标记样品的最优SOFI程序参数设置。实验结果表明，采用新型SOFI超分辨显微技术通过表达通用荧光蛋白EGFP表达活细胞线粒体膜结构时，空间分辨率为100nm，时间分辨率为0.07秒（单次重建）为0.7秒）超分辨率荧光成像，并首次使用SOFI技术观察到了线粒体外膜结构的动态过程。结果表明，新型SOFI超分辨率显微镜能够满足活细胞超分辨率成像的要求。本课题成果可应用于活细胞中细胞器精细结构的动态变化与相互作用等前沿生物学研究领域。该项目的实施进一步提高了超分辨显微镜的时空分辨率，将有助于推动我国高端生命科学仪器的自主研发，改变超分辨率显微产品被国外产品垄断的局面。