抑制TGF-β1/Smad 信号通路促进骨-肌腱结合部瘢痕愈合后的软骨性重塑

肌腱和韧带止点损伤修复后，骨-肌腱结合部（Bone-Tendon Junction，BTJ）仅以瘢痕连接愈合，难以恢复原本的软骨性连接，有损其传递和缓冲应力的功能，再损伤率高。TGF-β1是促使BTJ愈合中瘢痕形成的关键因子。我们在前期工作中通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抑制了瘢痕增生。在此基础上，本研究拟构建大鼠BTJ损伤修复模型，在体研究TGF-β1及Smad在其愈合过程中的分布与瘢痕形成的相关性；分别在愈合与重塑的不同时期，用针对TGF-β1、Smad2、Smad3的siRNA转染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信号通路，观察抑制后BTJ的细胞和细胞外基质的变化及生物力学改变，以期抑制愈合后的瘢痕增生，促进软骨性连接重塑，提高其极限负荷和强度。.本研究可望阐明TGF-β1/Smad信号通路对BTJ瘢痕愈合与重塑的调节机制，为基因治疗促进BTJ愈合后的软骨性重塑提供新的思路。

一、项目背景：肩袖损伤是一类常见的关节运动损伤类疾病，但是肩袖术后愈合失败发生再撕裂的比率仍然较高，腱骨界面常常被认为是关节损伤修复早期的薄弱点，外科手术修补后的肩袖以瘢痕重塑的形式愈合，有多种炎症因子和生长因子参与修复重建过程，而TGF-β1是促使BTJ愈合中瘢痕形成的关键因子，前人研究发现，通过抑制TGF-β1/Smad信号通路可以抑制瘢痕增生。.二、主要研究内容：通过构建SD大鼠冈上肌BTJ损伤的修复模型，在体研究TGF-β1及Smad在其愈合过程中的分布与瘢痕形成的相关性；分别在愈合与重塑的不同时期，用针对沉默TGF-β1、Smad蛋白家族设计的慢病毒感染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信号通路，观察抑制后的BTJ细胞和细胞外基质的变化及相关生物学、生物力学的改变，分析此信号通路对肩袖BTJ愈合的调节机制.三、重要结果：1、建立并完善了大鼠SD冈上肌损伤修复动物模型；2、设计并筛选出了针对SD大鼠高效抑制TGF-β1、Smad2、Smad3的siRNA序列，分别是：.TGFβ1：CAGCUGUACAUUGACUUUA 抑制率：65.39%±4.8；Smad2：CUGAAUAAGUAACUGGCTG 抑制率：72.58%±3.2；Smad3：GCUGUUCCAGCGUGUCUUA 抑制率：80.69%±2.6。3、确定了TGF-β1、Smad2、Smad3 各组siRNA的最佳转染浓度于时间：TGFTGFβ1 最佳转染浓度：100nmol/L; 最佳转染时间：48h；Smad2 最佳转染浓度：100nmol/L; 最佳转染时间：72h；Smad3最佳转染浓度：150nmol/L; 最佳转染时间：72h；4、对TGFβ1、Smad2、Smad3分别包装出对靶基因抑制有效的慢病毒（细胞水平验证），免疫印迹法检测各组抑制率为：TGFβ1：50.79%±12.3； Smad2：64.33%±4.6； Smad3：72.64%±7.5。.四、重要结论：1、慢病毒介导的RNAi技术可以作为沉默SD大鼠肩袖TGF－β1/Smad信号通路的安全有效的方法；2、抑制TGF－β1/Smad信号通路中TGF－β1、Smad2、Smad3不影响SD大鼠肩袖损伤愈合自然过程；3、抑制Smad3的表达有利于促进SD大鼠冈上肌损伤的愈合，改善瘢痕组织结构，促进BTJ软骨性重塑。