肝郁脾虚证胃溃疡大鼠差异性蛋白质的表达及柴黄胃溃宁干预作用

胃溃疡是消化系统常见病、多发病，胃溃疡属中医"胃脘痛"范畴，肝郁脾虚是其致病的重要因素。将蛋白质组学引入中医证候学的研究是探讨肝郁脾虚证机理的又一新的切入点，以及其整体、动态性的核心思想,与中医学的"整体观"和"辨证观"等理论体系有着惊人的类似之处,而这种研究思路与中医整体观和中药多靶点整合调节的特点不谋而合,具有明显的中医特色。中医学的研究已从宏观辨证发展到微观辨证，研制肝郁脾虚证胃溃疡大鼠模型，从蛋白质组水平、病证结合角度研究，通过对比正常组与模型组蛋白质表达差异，明确肝郁脾虚证胃溃疡蛋白质谱的变化；2、通过引进体外细胞的培养，构建药物血清的体外细胞平台，分析柴黄胃溃宁对肝郁脾虚证胃溃疡蛋白质谱变化。柴黄胃溃宁以不同剂量给药，从体内、体外实验，从药效角度，从量效上阐明治疗肝郁脾虚证胃溃疡的最佳治疗剂量。

目的 从蛋白质组学层面对病证结合模型开展研究，明确肝郁脾虚证胃溃疡差异性蛋白群；从体内、体外实验，分别验证该蛋白群，观察验方柴黄胃溃宁对该蛋白群的变化，探讨其作用机理。.方法 ①采用多因素复合模拟中医病因并结合乙酸法建立模型，通过多角度多指标，验证模型复建成功。②采用二维凝胶电泳结合质谱技术，筛选肝郁脾虚证胃溃疡大鼠模型的差异蛋白质表达谱，确定胃窦组织差异性蛋白群。③采用实时荧光定量PCR、Westrn Blot分别验证差异性蛋白，用验方不同剂量组干预差异性蛋白群，观察其疗效。④采用原代细胞系永生化技术，构建成功体外细胞平台。⑤摸索出验方各剂量组、黄芪建中汤组细胞平台内用药规律，采用MTS比色法开展细胞生长实验。⑥根据⑤的结果，利用免疫荧光法用激光共聚焦显微镜观察差异性蛋白在细胞内分布及表现的变化情况。.结果 ①成功建立肝郁脾虚证胃溃疡大鼠模型；验方能从多角度多指标改善肝郁脾虚证胃溃疡大鼠的情况（P<0.01）。②鉴定病证结合模型的差异蛋白质表达谱发现苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶-3、谷胱甘肽S-转移酶ɑ-2、调宁蛋白、延胡索酸酯水化酶、铜/锌超氧化物歧化酶、丙酮酸脱氢酶活性E为差异性蛋白。④从RT-PCR、WB两方面验证了部分差异性蛋白出现高表达，部分差异性蛋白出现低表达。不同蛋白受中药影响各不同，有些受验方影响大，有些受黄芪建中汤组影响大。④成功建立原代胃粘膜上皮细胞系，并成功转染。⑤细胞实验中，验方高、中剂量为6孔板中每孔10μl /孔、5μl /孔，浓度均为200mg/ml，转染并加药后孵育24h做细胞生长实验效果较佳。⑥已筛出的7个蛋白中部分差异性蛋白出现高表达，部分差异性蛋白出现低表达。用药干预后，有些受验方影响大，有些受黄芪建中汤组影响大。从20倍-100倍免疫荧光双染色结果也证实了这个结果。 .结论 ①肝郁脾虚证胃溃疡大鼠模型的确存在差异性蛋白质群，差异性蛋白质群与体内能量代谢、氧化还原反应密切相关。②体内实验与体外细胞实验结果均表明部分差异性蛋白质受验方影响大，部分受黄芪建中汤组影响大；验方的疗效与剂量大小相关，尤以中、高剂量组疗效较佳。③验方可能对不同的蛋白进行不同的上/下调来达到治疗胃溃疡肝郁脾虚证的作用。