单细胞水平lncRNA RP11-DDIT4-mTOR轴向调控抗原提呈B细胞的机制

Neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) is a common autoimmune disease of the central nervous system, with elusive mechanism and limited therapeutic efficacy. Taking advantage of a microfluidic platform enabling single-cell RNA-seq, bioinformatic analysis and experimental approach to cell function, we hypothesized that DDIT4-targeted lncRNA RP11 plays a crucial role in the pathogenesis of NMOSD, via mTOR signaling pathway involving activation of antigen-presenting B cells. Integrating neurobiology, molecular biology and genetics, this single-cell-based project uses techniques such as Cre/loxP system to generate conditional knockout mice to explicit our hypothesis both in vivo and in vitro. We demonstrated that abnormal upregulation of lncRNA RP11 may contribute to the dysregulation of autophagy, resulting in activation of antigen-presenting B cells and disruption of immune regulation, suggesting an essential role of lncRNA RP11-DDIT4-mTOR axis in the pathogenesis of NMOSD. These studies can not only clarify the role of lncRNA signaling network in the regulation of antigen-presenting B cell activation but also provide insights for developing diagnostic and therapeutic strategies for NMOSD.

视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是致残率较高的常见神经免疫疾病，目前发病机制不明，治疗手段有限。课题组前期采用微流控平台进行单细胞RNA组测序，通过生物信息学分析及细胞功能实验发现抗原提呈B细胞活化相关长链非编码RNA--lncRNA RP11，并提出假设“lncRNA RP11靶向作用DDIT4基因，借助mTOR通路活化抗原提呈B细胞，参与NMOSD发病进程”。由于抗原提呈B细胞数量少、异质性强，难以用常规方法研究，因此项目以单细胞为视角，拟整合神经生物学、分子生物学和遗传学，采用Cre/loxP系统条件性敲除小鼠等技术，从体内外两个层面论证NMOSD中lncRNA RP11异常升高，导致自噬活动失调，从而激活抗原提呈B细胞，诱发免疫紊乱的调控机制。阐明lncRNA RP11-DDIT4-mTOR调控轴在NMOSD发病中的作用，为NMOSD的诊治提供新思路。

视神经脊髓炎谱系疾病（Neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一组水通道蛋白4（Aquaporin 4，AQP4）抗体阳性率较高的神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病，是神经病学领域近10 年来临床诊治更新和进展最快的疾病之一。随着神经免疫性脱髓鞘疾病研究和诊断水平的提高，NMOSD 已成为临床常见的神经系统疾病之一。申请者围绕免疫性脱髓鞘疾病进行了多项研究。然而目前其发病机制不明，治疗手段有限。因此课题组对增殖诱导配体和B 淋巴细胞刺激因子通路在NMOSD 发病中的作用机制进行探讨。B 细胞是一群功能非常复杂的异质性免疫细胞，其中具有抗原提呈功能的亚群——抗原提呈B 细胞（Antigen presenting B cells，APBC）不仅具有抗原提呈的高效性，而且与NMOSD 发生发展存在关联。抗原提呈B 细胞具备重要的免疫抗原提呈功能，其自身调控是一个多因素参与的复杂过程，其中长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）的调控作用日益受到重视。lncRNA 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，在调控免疫细胞过程中发挥重要作用。本课题从体内外二个层面展开，首先以NMOSD患者外周血抗原提呈B细胞为研究对象，采用在微流控芯片上进行单细胞RNA组测序的方法，通过生物信息综合分析聚焦lncRNA RP11及靶基因DDIT4，采用敲减/过表达lncRNA RP11、RNA pull down 试验、DDIT4基因回补实验、mTOR 抑制剂及敲减自噬介导因子ATG12等方法，系统阐述lncRNA RP11-DDIT4-mTOR-自噬轴向调控抗原提呈B细胞的机制。体内研究以NMOSD 小鼠模型为对象，采取AMPK抑制剂、mTOR抑制剂阻断通路的方法，通过分析小鼠模型行为表征、组织形态学、抗原提呈B 细胞活性及T细胞分型的方式，明确lncRNA RP11在NMOSD模型中的作用。本项目结果进一步阐明了lncRNA调控抗原提呈B细胞活化的信号网络，为NMOSD的诊断和治疗提供了新的思路和方法。申请者进一步对中药虎杖通过对调节B细胞的影响起到治疗NMOSD疾病作用机制进行了探讨，为今后中药干预治疗NMOSD奠定了基础。