基于ChIP-Seq技术探讨组蛋白修饰在补肾法防治骨质疏松症中的表观遗传机制

Epigenomics is the study of the complete set of epigenetic modifications on the genetic material of a cell which provides the strategy for precise medicine. Emerging evidence suggests histone modification enzymes play a hugely part in both gene expression and function in bone formation resulted from the change of histone modification. Our previous study indicated that JMJD2 family of histone demethylase is positive related with bone density and estrogen receptor α/β. However, the role of histone epigenetic modification in the development of osteoporosis and its mechanism in “Nourishing Kidney” Chinese formula regulating osteoporosis are still unclear. In this study: ① ChIP-sequencing, RNA-sequencing etc. were used in the models including osteoblasts differentiation of bone mesenchymal stem cells (BMSCs), OVX animals and patients with osteoporosis to find the relationship among the histone epigenetic modification, key genes in bone formation and Chinese herbs; ② CRISP, RNA-sequencing etc were used to explore the mechanism of key histone modification enzymes in the couple of osteoblasts and osteoclasts during the progress of osteoporosis which provide the new way and theoretical evidence for the precise Chinese Medicine in treatment and prophylaxis of osteoporosis.

表观基因组学作为在全基因组水平上对表观遗传修饰转变的研究，为人类疾病精准治疗提供了新策略。最新研究证实组蛋白修饰酶可以通过改变组蛋白表观遗传修饰，在骨形成关键基因的表达和功能发挥中起重要作用。我们前期研究发现，组蛋白去甲基化酶JMJD2家族与骨密度及雌激素受体α/β显著正相关，但组蛋白表观遗传修饰在骨质疏松的发生、发展过程中的分布、改变以及补肾法的调控仍需深入探讨。故本项目拟：①采用染色质免疫沉淀-测序（ChIP-seq）等技术手段，借助骨髓间充质干细胞成骨分化模型，骨质疏松动物模型、病人临床样本，研究组蛋白表观遗传修饰与OB、BMSCs骨形成基因、骨转化的关联，及补肾中药和基因组水平组蛋白表观遗传修饰的关系；②采用CRISPR、RNA-seq等技术手段，探明关键组蛋白修饰酶在成骨-破骨耦联中作用机理，进一步阐述与骨质疏松的相关性，为中医药精准防治骨质疏松提供新思路和理论依据。

骨质疏松症已成为全球性健康问题，组蛋白修饰在内的表观遗传修饰在不涉及DNA序列改变的前提下，通过某些机制引起可遗传基因表达和功能的变化，已成为肿瘤及代谢类疾病的热点。中医药“补肾法”在慢性骨代谢类疾病如骨质疏松症中疗效确切，然而在骨质疏松症中，其与表观遗传学相关性以及其中基因调控关系、分子作用机理等尚不清楚。表观遗传学对中医学“天人合一”等哲学思想也尚未有较好的现代化解读与阐释。基于以上背景事实，并结合骨质疏松症临床治疗与研究的需要，我们申请并开展了此项研究。我们主要从人体、细胞、动物三个维度，对组蛋白修饰为主的表观遗传修饰现象在补肾法防治骨质疏松症中的具体机制进行了探索，为中医药补肾法治疗骨质疏松提供现代分子生物学依据与实验研究基础。主要实验内容，结果数据以及推论如下：.1.在人体临床标本方面应用了DNA甲基化测序技术，检测并发现临床骨质疏松性骨折病人SOST基因CPG岛的差异变化，并与成骨-破骨偶联OPG/RANKL比例相关。.2.建立了体外成骨-破骨细胞分化模型，探讨了补肾中药仙灵骨葆胶囊及部分中药单体对其影响及表观遗传机制。确定了仙灵骨葆胶囊靶向miR-100-5p/KDM6B/RUNX2轴促进MC3T3-E1成骨分化的分子机制。也首次筛查出了部分具有抑制破骨分化及促进成骨分化的中药单体。.3.在细胞层面应用RNA-sequencing技术与Chip技术，研究OB、BMSCs成骨分化中基因表达谱的变化，发现了组蛋白修饰酶KDM4A、KDM7A在骨髓间充质干细胞成骨分化中差异性表达，通过荧光素酶报告基因实验以及IHC、IF、Western blot、RT-qPCR明确了上调组蛋白修饰酶KDM4A、KDM7A等可促进骨髓间充质干细胞成骨分化。.4.在动物模型层面成功建立了体内骨质疏松症模型，明确了补肾中药仙灵骨葆胶囊防治骨质疏松大鼠表观遗传机制，发现其主要调控表观遗传调控因子H3K36me3、H3K9me3及JMJD2A 表达水平发挥抗骨质丢失作用。.5.在完成组蛋白修饰研究内容的情况下，基于研究持续深入的原则，进一步对表观调控因子RNA去甲基酶FTO进行了前期探索并发现了FTO介导的m6A修饰主要通过靶向PPARG分子从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化，有望为骨质疏松的诊疗提供更精准的分子靶向研究基础。