硬骨鱼类雌性性别决定和分化的分子机制研究

Rspondin-１ (RSPO1) signalng pathway plays an important role in female sex determination and differentiation in mammalian species. However, studies on the roles of Rspo1 signaling pathways in sex determination and differentiation in fish have not been reported. For the first time, we proposed that Rspo1 signaling pathway acts as a key factor in controling the direction of gonadal differentiation in female teleosts. By using tilapia and medaka as models, we will use real-time PCR, in situ hybridization and immunohistochemistry etc. to study the spatial and temporal expression profiles of Rspo1 and two types of β-catenin. Hormone treatment experiments will be performed to investigate the relationship between Rspo1 signaling pathways and estrogen pathway.In vivo gene mutation by medaka ENU library screesning (loss of function in XX) and over-expression (gain of function in XY) experiments will be carried out to figure out the functions of Rspo1 signaling pathway in female sex determination and differentiation. Promoter analysis using dual luciferase system will be performed to clarify the molecular mechanism that the Rspo1/β-catenin signal pathway regulates the key factors, which are related to meiosis and the synthesis of estrogen. The final aim of this study is to elucidate that Rspo1/β-catenin signaling pathway plays essential role in female sex determination and differentiation in the teleosts by coordinating with estrogen and regulating　the meiotic initiation of germ cell.

Rspondin(Rspo1)信号通路在哺乳动物雌性性别决定和分化过程中有重要作用。然而该信号通路在鱼类性别决定和分化过程中作用的研究尚未见报道。我们首次提出Rspo1信号通路在硬骨鱼类雌性性别决定和分化过程中有重要作用。本项目将以罗非鱼和青鳉为研究对象，利用实时定量PCR、原位杂交和免疫组化等方法研究Rspo1信号通路基因的时空表达模式。通过激素处理研究Rspo1信号通路和雌激素合成的关系。并通过基因突变（XX）和过表达（XY）等实验从失活和获得基因功能两个方面研究Rspo1信号通路在硬骨鱼类雌性性别决定中的功能。通过荧光素酶报告基因分析研究Rspo1信号通路调控雌激素合成的关键转录因子和生殖细胞减数分裂相关因子的分子机制。最终阐明硬骨鱼类Rspo1信号通路通过与雌激素合成协同作用，并通过调节生殖细胞减数分裂启动，进而在硬骨鱼类雌性性别决定和分化过程中发挥重要作用。

由于大部分鱼类存在性别二态性，因而其经济价值、生长速度、养殖效益、观赏价值等也存在性别差异，因此对鱼类性别决定机制和性别控制的研究是水产养殖领域重要组成部分。Rspo1/β-catenin信号通路在哺乳动物雌性性别决定和分化过程中有重要作用。然而该信号通路在鱼类性别决定和分化过程中作用的研究尚未见报道。我们以罗非鱼和鲭鱂为实验材料，紧紧围绕Rspo1/β-catenin这一信号通路在硬骨鱼类雌性性别决定与分化中的作用机制开展工作。我们通过对TopFlash载体离体细胞培养实验，验证了鱼类Rspo1能够通过β-catenin1激活下游TCF/TEF 靶基因，证明鱼类Rspo1/β-catenin可能具有保守的调节机制。通过Rspo1/β-catenin通路抑制剂罗非鱼DKK-1重组蛋白对孵化后3个月卵巢的离体处理，发现该通路的抑制导致雄性通路基因的表达上调，而雌激素合成酶基因cyp19a1a基因的表达被抑制。采用最新的基因敲除技术（TALEN和CRISPR/Cas9），在罗非鱼成功实现Rspo1/β-catenin信号通路关键分子的基因敲除。发现Rspo1或者β-catenin基因在XX个体的敲除，在孵化后2、3个月都出现卵巢分化的延迟和阻滞，严重影响卵原细胞的增殖和减数分裂启动过程，并且雌激素合成酶基因Cyp19a1a的表达和雌激素合成水平显著下降。同时，雄性特异基因如：amh，gsdf和cyp11b2在敲除XX个体的表达显著增加。通过H.E.染色，免疫组化和EIA等方法深入研究了基因敲除突变体对性腺形态，内分泌合成和分子水平的影响。同时通过转基因过表达青鳉Rspo1等实验，发现Rspo1基因在XY个体的过量表达，能导致其完全性逆转为可育雌性。同时发现雌性特异基因（foxl2, cyp19a1a等）的表达上调，而雄性特异基因（dmrt1, gsdf等）的表达下降。同时发现从孵化后0天开始，雄激素testerone的合成水平下降，相反雌激素的合成水平显著升高。总之，本项目深入研究了Rspo1/β-catenin在硬骨鱼类雌性性别分化中的作用和分子机制。