牡丹花粉管与雌蕊识别过程的转录组分析及调控结实关键基因挖掘

Seed setting is an important factor limiting tree peony seed oil yield and germplasm innovation, while, fertilization success is a key factor for tree peony seed setting. Multiple genes involved in fertilization process, which is a very complicate and delicate biological phenomena, however, the molecular mechanism on this process of tree peony is still unknown, which seriously affected the development and utilization of tree peony, therefore, it is urgent to carry out related research. We had analyzed fertilization barrier in the process of tree peony fertilization by seed setting investigation and cytological observation. Based on our previous study, we will attempt to obtain the transcript profiling during the process of fertilization of tree peony that using pistils before or after pollination as materials, through next-generation sequencing technique, and analyze the differential expression profile, try to screen the key genes which may be responsible for the recognition between pollen tube and pistil. Meanwhile, the expression level of candidate genes will be validated by qRT-PCR. Furtherly, the gene silencing, transforming to model plants and functional complementation methods were also used to investigate the candidate genes biological function. Finally, we will demonstrate the mechanism of recognition between pollen tube and pistil in fertilization process by combining the results of cytological and molecular biology, which will lay the foundation for understanding the process of fertilization, improving the seed setting rate for tree peony seed production and increasing the efficiency of breeding for germplasm innovation.

结实是限制油用牡丹产量和种质创新的重要因素，受精成败又是影响牡丹结实性的关键生殖过程，此过程涉及到很多基因，是一个非常复杂而精细的生命现象，然而牡丹中有关这一过程的内在机制却一无所知，严重影响了牡丹的开发和利用，亟待开展相关研究。本项目组前期通过结实性调查、细胞学观察，对牡丹受精过程中的受精障碍进行了研究。本项目拟在前期研究的基础上，通过进一步对受精过程的细胞学观察和结实性调查，结合高通量测序技术，以授粉前、授粉后不同时期的雌蕊为材料，获得授粉受精过程中的转录谱，筛选可能参与牡丹花粉管-雌蕊识别的关键基因；对候选基因通过荧光定量PCR技术进行表达分析；并通过过表达拟南芥和牡丹体内的基因沉默技术对候选基因的功能进行鉴定，从细胞学和分子生物学角度揭示牡丹受精过程中花粉管-雌蕊识别的分子调控机制，为提高牡丹结实率、指导种子生产，提升远缘杂交育种效率、种质创新奠定基础。

结实是限制油用牡丹产量和种质创新的重要因素，受精成败又是影响牡丹结实性的关键生殖过程，此过程涉及到很多基因，是一个非常复杂而精细的生命现象。本项目以调控受精进而调控结实为切入点，以‘凤丹白’雌蕊为研究材料，以其授粉过程中的花粉管萌发伸长过程为依据，选择圆桃状花蕾期（S1）、授粉后24 h （S3）和授粉后48 h （S4）的雌蕊进行转录组测序和分析，共获得unigenes总数为113,489个。从差异表达基因中获得了大量转录因子和受体蛋白激酶，大量差异表达基因与植物生长发育有关，并筛选到多个与花粉、胚囊功能有关的基因。利用荧光定量PCR对各类转录因子、酶和功能蛋白基因进行时空表达分析，推测有多个基因参与调控结实。结合转录组数据分析、荧光定量结果和功能注释，选择了PobHLH、PoLIM、PoMYB1和PoMYB2进行克隆分析。PobHLH、PoLIM、PoMYB1和PoMYB2编码区长度分别为1,338 bp、567 bp、864 bp、1854 bp，分别编码445个、191个、287个、617个氨基酸。采用荧光定量PCR分析其表达模式，PobHLH、PoLIM、PoMYB1、PoMYB2均在授粉后48 h（S4）表达量最高，其次为授粉后24 h（S3）、圆桃状花蕾期（S1），柱头分泌粘液期（S2）表达量最低。对PobHLH和PoLIM转基因拟南芥、对PoMYB1和PoMYB2转基因烟草进行表型验证，发现PobHLH转基因植株Line11花序长度为野生型的2.27倍，Line14花序分枝数量最多，为野生型的2.75倍，Line5的结实量最大，为野生型的1.89倍。PoLIM转基因植株花序分枝数量显著多于野生型植株，结实量大于野生型植株。PoMYB1转基因植株Line1和Line6花冠筒、幼叶叶脉、叶片基部、萼片、果皮和种皮等部位均出现了野生型没有的红色。构建了（注射花柄部位，菌液OD600值为1.0，注射1次）鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS技术体系。从30个品种中筛选出了4个能够提高种子中不饱和脂肪酸含量尤其是α-亚麻酸含量的‘凤丹’优良花粉供体，以提高油用种子的品质。本项目初步揭示了牡丹受精过程中花粉管-雌蕊识别的分子调控机制，为提高牡丹结实率、指导种子生产，提升远缘杂交育种效率、种质创新奠定基础。