Wnt信号通路在牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化中作用的研究

Wnt信号通路对牙发育及骨形成具有重要作用。牙囊中含有未分化的干细胞，受诱导后可向骨/牙骨质分化，然而有关牙囊分化的信号通路机制尚不明确。本课题组早期实验发现Wnt信号通路中的重要蛋白β-catenin在体内外牙囊细胞均有表达，β-catenin在出生1-13天的大鼠牙囊中表达逐步提高，用LiCl刺激牙囊细胞可促进β-catenin从胞浆转移至胞核，提高核β-catenin和骨保护素的表达，推测Wnt信号通路可能参与调节牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化。因此，本实验拟通过基因芯片技术检测体外培养牙囊细胞经成骨诱导前后的Wnt信号通路差异基因表达谱，观察Wnt经典和非经典信号通路的激活情况，利用免疫组化、原位杂交、免疫荧光、Western blot、稳定转染及RNA干扰，筛选对牙囊细胞成骨/成骨向分化的关键基因，从体内水平验证Wnt信号通路关键基因对牙囊分化的影响，为牙再生的调控提供新思路。

牙囊是包绕于成釉器和牙乳头外周的疏松结缔组织，牙囊中包含的前体细胞在牙发育后期可形成牙周膜、牙槽骨和牙骨质。多种细胞因子和信号通路构成的网络结构参与调控牙囊细胞在破骨和成骨/成牙骨质机制的双重作用。 Wnt信号通路可分为Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）经典信号通路和非经典信号通路。 Wnt在组织发育和多种疾病中发挥作用，也是间充质干细胞（MSC）成骨向分化的关键调节因素之一。牙髓干细胞、牙周膜干细胞和牙囊前体细胞的分化过程中均有Wnt信号通路的参与，但其机制尚不明确。. 本项目组成功培养并获得纯化的大鼠牙囊细胞，验证了其成骨、成脂向分化能力，通过观察Wnt/β-catenin信号通路中心蛋白β-catenin、 配体Wnt3a、抑制剂DKK3、Nkd2和非经典信号通路关键蛋白Wnt5a在体内大鼠牙囊组织和体外培养大鼠牙囊细胞的表达，及其对牙囊细胞增殖和成骨/成牙骨质向分化能力的影响，探讨Wnt信号通路对大鼠牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化的影响及其机制。. 研究发现：① LiCl可经由调控Wnt/β-catenin信号通路间接促进牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化；β-catenin表达水平和牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化能力正相关。Wnt相关基因差异表达谱发现Fzd1、Wif1、Nkd2、Ccnd2的差异表达。②Wnt3a 在出生后大鼠牙囊组织中的具有表达呈时空特异性；Wnt3a促进牙囊细胞内β-catenin 及成骨/成牙骨质向分化相关蛋白表达。③ Wnt5a在成骨诱导分化期促进牙囊细胞成骨向分化，后期促进牙囊细胞向破骨细胞分化，可能起到调节骨代谢平衡的作用。Wnt5a通过激活JNK和Ca2+通路促进牙囊细胞成骨向分化作用，同时Wnt5a和BMP2协同促进牙囊细胞矿化。④ DKK3 参与调控牙囊细胞成骨/成牙骨质向分化并且参与调控 Wnt/β-catenin 信号通路。⑤Lhx8通过激活Wnt和TGFβ信号通路调控牙发育。⑥Nkd2促进牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化。. 本项目证实了Wnt经典和非经典信号通路均参与了大鼠牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化过程，并起正向调控作用；深入探讨了Wnt信号通路大鼠牙囊细胞的成骨/成牙骨质向分化的调控机制；确定了Wnt信号通路中有关牙囊分化的关键蛋白，为深入探讨牙囊发育的分子机制和牙再生提供了新