基于化学交联和基因编辑的DNA-蛋白质复合体标记、富集和鉴定新方法研究

In order to solve the major technology difficulties in large-scale DNA-protein interaction complex analysis and establish new strategies for panoramic & targeted study of DNA-protein complex, we propose to develop novel methods for living-cell site-specific complex labeling, selective cross-link, highly efficient enrichment and mass spectrometry identification. Via synthesis of new cross-link reagents, development of in situ cross-link methods, selective complex enrichment and separation, we expect to achieve highly sensitive mass spectrometry identification of DNA-protein complex with deeper coverage, discovery of unknown DNA-protein interaction and distinguishing between direct and indirect interaction. Furthermore, in order to solve the lack of tools for enrichment and identification of epigenetic modification induced DNA-protein complex, we propose to develop novel living-cell site-specific (methylated) DNA labeling and enrichment methods using CRISPR/Cas gene editing technology. The application of the above strategy will lead to successful identification and quantification of the types, composition, content and dynamic changes of the complexes and facilitate structure analysis and function study of the complexes as well. We will integrate the above new reagents & methods and apply them in the research of the correlation and regulating mechanism of DNA damage & repair, drug resistance in chemotherapy and corresponding (methylated) DNA-protein complexes.

针对DNA-蛋白质相互作用复合体规模化研究中面临的主要技术瓶颈，本项目从活细胞中复合体的定点标记、特异性交联、高效富集和质谱鉴定等几个方面入手，建立DNA-蛋白质复合体的全景式、靶向性研究新策略。通过合成新型多功能交联试剂，发展活细胞原位交联、特异性富集和分步释放的分离方法，实现高灵敏度的DNA-蛋白质复合体的深度覆盖，未知DNA-蛋白质相互作用的发现，以及间接和直接相互作用的精确区分。发展基于CRISPR/Cas基因编辑技术的（甲基化）DNA原位定点标记和复合体靶向富集新方法，解决表观遗传修饰介导的DNA-蛋白质复合体，目前缺乏有效富集鉴定手段的难题。实现复合体种类、组成及含量动态变化的定性与定量，为其结构解析和功能研究提供有力支撑。有机整合上述新试剂、新方法，将其应用于DNA损伤条件下及肿瘤治疗过程中，（甲基化）DNA-蛋白质复合体和与肿瘤耐药性的内在关联研究，推动相关调控机理的发现。

细胞中生物大分子间的相互作用是各种生命现象的基础。作为生物体内最重要的两类生物大分子，单独存在的核酸或蛋白质往往不能行使其功能，而需要通过二者间，以及与其他大分子、小分子间发生一系列相互作用，形成纷繁复杂的功能复合体来发挥生物学功能。二者间的特异性识别和相互作用在生命过程中扮演着至关重要的角色，并与包括癌症、代谢性疾病在内的多种人类重大疾病密切相关。因此，发展全面而精准的分析方法，系统地鉴定和表征细胞内核酸-蛋白质相互作用所形成的复合体网络及其动态变化，对理解生命现象的本质，探索重大疾病的发病机理、发展过程等科学问题有着极其重要的意义。针对当前核酸-蛋白质复合体的规模化分析面临的主要技术难点，本项目发展了多种核酸结合蛋白富集探针和材料，以及核酸结合蛋白及其翻译后修饰的串联富集新方法，著提高了核酸结合蛋白及其上糖基化、酸磷酸化修饰的富集鉴定规模。并探索了顺铂与奥沙利铂与DNA的结合方式以及对DNA结合蛋白磷酸化修饰的影响，为铂类药物的抗癌机制研究提供了重要方法和数据。经过2017-2020四年实施，本项目进展顺利，完成了申请书和计划书中的既定研究内容。以（共同）通讯作者共计发表SCI论文9篇，其中影响因子大于10的一篇，10>影响因子>5的六篇，申请发明专利3项，按计划完成了项目计划书规定的指标。其中三篇文章分别被Chemical Science、Chemical Communications和Analyst选为封面或封底文章。