脑静脉血栓形成致脑水肿发生的机制研究

Malignant brain edema is the first leading cause of death from cerebral venous thrombosis (CVT). However, the underlying mechanism is still unclear. Aquaporin 4 (AQP4) plays a critical role in the development of cytotoxic cerebral edema; and vascular endothelial growth factor (VEGF) is a major factor that causes vasogenic brain edema. Both are regulated by high mobility group box 1 (HMGB1). We have successfully established a mini-pig and Rat CVT model, and found that the expression level of VEGF and AQP4 were significantly increased 24 hours after CVT. Therefore, this study hypothesis that: the over-expression of VEGF and AQP4 dual cell signaling pathway mediated the formation of malignant cerebral edema induced by CVT. This study intends to use Rat and mini-pig CVT model to verify our hypothesis and reveal the molecular mechanism of CVT-induced brain edema. We will first explain whether CVT induces an overexpression of VEGF and AQP4 in the CVT animal model, and the underlying mechanism. The results will provide important experimental evidence for improving the clinical prognosis of CVT.

恶性脑水肿是导致脑静脉血栓形成(CVT)死亡的首要原因，但其机制尚不清楚。已知水通道蛋白4 (AQP4)在细胞毒性脑水肿发生中起关键作用，而血管内皮生长因子(VEGF)则是引起血管源性脑水肿的主要因子，两者都接受高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的调控。我们前期已成功建立了小型猪和大鼠CVT模型，并发现CVT发生24小时后VEGF和AQP4蛋白表达水平显著升高。因此，本研究将提出以下假设：VEGF和AQP4双重细胞信号途径介导了CVT所致恶性脑水肿。我们将采用大鼠和小型猪CVT模型验证我们的研究假设并揭示CVT引起脑水肿的分子机制。研究首先在CVT动物模型中确定CVT引起VEGF和AQP4过表达；探讨CVT是否可以通过HMGB1途径使VEGF和AQP4表达增高及其相关机制，并证实阻断VEGF和AQP4信号通路是否可减轻脑水肿的程度。研究结果将为改善CVT临床预后提供重要实验依据。

目的:CVT形成后的分子机制探索有助于改善CVT预后。方法：大鼠中利用TTC、免疫荧光、病理染色和行为学测试等方法分析了VEGF基因在CVT神经损伤中的作用。为探究AQP4在大鼠及猪中对CVT预后发挥作用，我们用WB，行为学，免疫荧光等探索AQP4分子机制。结果：VEGF是一个可能影响CVT预后的Hub基因。结果显示，VEGF基因敲除后，脑梗死区缩小(P<0.001)，HE染色神经损伤减轻(P<0.001)，神经功能评分提高(P<0.001)，血脑屏障通透性改善(P<0.001)，脑含水量降低(P<0.001)，提示VEGF是CVT恶性预后的调节因子。转录组测序结果显示，ewsr1参与了VEGF对CVT预后的调控。EWSR1改变了细胞的病理生理变化（细胞凋亡（p＜0.05）和氧化应激途径（p＜0.001））。我们进一步通过siRNA转染敲低VEGF表达和质粒过表达EWSR1初步确认VEGF-EWSR1信号通路能够改善OGD/R后细胞的预后（CCK-8（p＜0.01），氧化应激反应（p＜0.01）和细胞凋亡（p＜0.05））。在对AQP4在大鼠CVT后探究中，首先发现抑制AQP4导致CVT后24小时脑水肿减轻（p＜0.05）。在CVT后24小时，抑制SHP-1导致NF-kB磷酸化和AQP4表达增加（p＜0.05），并加重脑水肿。SHP-1可能通过NF-kB的磷酸化来调节AQP4的表达，从而参与CVT诱导的脑水肿。在AQP4在猪CVT后探究中，首先AQP4在model组比sham组高，具有显著意义（p＜0.05），AQP4在AAV-AQP4组较AAV-Scramble组表达量减低（p＜0.05）。HE病理结果显示AAV-AQP4组较AAV-Scramble组损伤神经元减少。WB实验结果显示MEF2C被敲低后AQP4的表达量同样减低。Purdy评分发现AAV-Scramble组较AAV-MEF2C组神经损伤减轻，具有显著意义（p＜0.01）。AAV-Scramble组较AAV-MEF2C组神经元损伤减小。结论：VEGF参与了CVT后神经损伤的病理过程，VEGF-EWSR1信号通路是治疗CVT预后的潜在治疗靶点。SHP1/NF-κB/AQP4是调控大鼠脑神经损伤的分子信号通路。MEF2C-AQP4是调控猪神经损伤的分子信号通路。