最简密码子无细胞蛋白生物合成系统

Hijacking genetic code system for artificial designed purpose, in the past few decades, is becoming a very hot research focus for synthetic biology and system biology. Thus far, engineered genetic code or decoding system, such as suppressor tRNA system, has been developed for incorporating non-natural amino acid into ribosome mediated protein synthesis. As significant progresses in synthetic biology, the whole genome of special organisms were redesigned with reduced codon usage. In this research, 20 recombinant tRNA genes will be developed for isolation of highly purified tRNA molecule. With introducing the minimal transfer RNA set into a cell free protein synthesis system PURE, which is constructed from highly purified E.coli translational protein factors and ribosome, a complete new cell free protein synthesis system can be constructed. In this new system, amino-acid, tRNA, aminoacyl-tRNA synthetase and genetic code, the four essential elements of genetic coding system will be connected one-by-one in a straight-line relationship. The competition for special codon from endogenous decoding system of cell will be completely removed from the PURE system. Therefore, PURE system will be a powerful fundamental platform for achieving our research goal. Here, we will create a new genetic coding system, “One Amino-acid One Codon” system, with most reduced codon usage. We believe that this “One Amino-acid One Codon” system hold great potential in further genetic codon engineering researches, and become a powerful tool for artificial protein synthesis.

本项目以构建具有“最简化密码子”的无细胞蛋白生物合成系统为研究目标。近年来，遗传密码系统的人工改造成为基因组人工设计合成、人造生命系统等合成生物学研究的热点。本研究通过分离纯化20种活性转运RNA，构成蛋白翻译反应必需的最小转运RNA集合，实现氨基酸、转运RNA、氨基酰转运RNA合成酶以及20种密码子间形成绝对线性的一一对应关系，构建“One Amino-acid One Codon”无细胞蛋白合成系统。本研究以一个完全由高度纯化的蛋白因子构成的“PURE”无细胞系统为基础，充分利用其最大限度的排除了细胞内大量冗余的内源转运RNA干扰的优势，这也是本研究区别于现有细胞内研究的特色。从工程控制的角度来看，这种遗传密码的“瘦身”能够更加稳定蛋白合成反应，产生适合工业化控制的“健康”效果。可期待本研究能够成为密码子人工重排，非天然氨基酸蛋白合成等遗传密码系统改造研究的技术平台。

本项目核心研究内容旨在构建基于模式微生物大肠杆菌的蛋白分子无细胞生化合成系统，且重点基于此系统对遗传密码解读的核心分子机制之一，转运RNA进行系统化研究，无细胞生物合成是一种相对“开放”的体系，具有能够超越天然细胞生物活性 功能的研究潜力。.本研究项目开发了利用蛋白酶介导蛋白降解技术，通过基因组编辑对大肠杆菌中必需蛋白融合高特异性的降解多肽标签，异性地降解带有降解标签的靶蛋白。在活细胞内，靶蛋白处于基因组持续表达和蛋白酶持续降解的平衡状态，无法实现完全降解，然而我们在本研究中首次证明了在无细胞蛋白表达系统的备过程中，随着基因组等大分子的去除，该平衡被打破，最终得到了靶蛋白完全去除的无细胞蛋白表达系统，并且我们成功地验证了这种正交降解系统不会影响后续的目的蛋白合成，成功地证明了这一技术可以作为一种生化活性可设计的无细胞蛋白合成生物系统。.为了系统性研究转运RNA，我们首先研究了翻译终止系统，这一系统对于转运RNA在功能上有一定的竞争效应。本研究通过将已知的类型I的终止密码子识别终止因子RF1，RF2以及相关的RF3，RRF等因子都进行了蛋白水平去除，并通过高通量转录组测序筛选发现了两个可以替代RF行使翻译终止功能的新因子。本研究还克隆了大肠杆菌所有tRNA基因，并对每一个tRNA分子的翻译密码子进行了终止密码子替换，构建了192个tRNA分子文库，并对其进行了系统性地活性研究，并在给出了最简密码以及全64有意密码子的无细胞蛋白合成中的转运RNA分子集合。.利用本研究开发的翻译终止功能缺失及遗传密码全改造的无细胞蛋白表达系统中，我们还实现了高效的非天然氨基酸插入，尤其是在复杂的多位点多种类非天然氨基酸同时插入研究。本研究构建了一套全新的功能定制化的无细胞蛋白合成系统，并具有定制化的tRNA的分子集合，这些研究成果将推进复杂蛋白质工程以及自上而下的合成生物学以及非天然蛋白的研究进程。