ARK5/p38MAPK/Pim-3信号通路在胃癌发生、发展中的作用及机制研究

寻找早期诊断、化疗敏感性、预后的生物指标以及治疗靶点是胃癌研究的重点和热点。本项目在前人与自身工作的基础上，拟收集病理确诊的胃癌患者组织及血液标本160例，探讨ARK5与Pim3与胃癌病理类型、转移等临床病理参数的相关性；采用基因克隆与RNAi技术，拟构建ARK5、ARK5-RNAi、Pim-3、Pim-3-RNAi腺病毒表达载体，转染SGC7901胃癌细胞株，并给予p38MAPK特异性阻断剂SB203850，从细胞水平去研究ARK5、p38MAPK、Pim-3的上下游关系，以及它们在胃癌发展中所起的作用；在转基因细胞株上探讨Pim-3基因对死亡受体通路、内质网应激通路和线粒体凋亡通路等多方位的抗凋亡的机制；建立裸鼠皮下移植瘤动物模型，从整体动物水平去确认ARK5/p38MAPK/Pim-3信号通路在胃癌发展中所起的作用；可望进一步研究胃癌发展的分子机制，为胃癌诊治提供理论、实验依据。

本课题首先经免疫组化证实ARK5基因在胃癌组织中表达明显升高，且在进展期胃癌组织中的表达明显高于早期胃癌。为探讨ARK5基因在胃癌发生、发展中的作用，本课题模拟肿瘤生长的微环境，建立缺氧模型，结果发现胃癌SGC7901细胞的ARK5基因明显上调并被磷酸化激活，故本课题构建了ARK5-RNAi慢病毒表达载体，转染入胃癌SGC7901细胞，在缺氧环境下显示胃癌细胞的肿瘤生物学行为均有所下降。本课题接下来对ARK5所涉及的信号通路进行研究，发现缺氧可致胃癌SGC7901细胞中的p38MAPK明显被磷酸化激活，并且此激活行为是由磷酸化激活ARK5所介导，进一步研究发现，缺氧还可导致原癌基因Pim-3的表达上调，免疫组化结果也证实进展期胃癌Pim-3的表达明显高于早期胃癌。但当基因沉默ARK5或给予p38MAPK通路的阻断剂，胃癌细胞中Pim-3的蛋白表达均下降，同时，胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡等恶性肿瘤的生物学行为明显削弱。Pim-3基因作为原癌基因，最主要的功能是抑制凋亡，故本课题接下来构建Pim-3-RNAi慢病毒表达载体，感染人胃癌SGC7901细胞，检测葡萄糖调节蛋白（GRP）78、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 (CHOP)、 caspase-12，细胞色素C（Cyt C）、凋亡诱导因子( AIF) 、 Caspase-9, 死亡因子受体( Fas) 、死亡因子 Fas 配体( FasL)、TRAF-2( TNFR-associ- ated factor-2) 、NF-κB 诱导激酶( NIK) 、NF-κB 、Caspase-8的表达及活性，从内质网应激通路、及线粒体凋亡通路及死亡受体通路三方面检测Pim-3的抗凋亡机制，结果提示，Pim-3主要是通过抑制线粒体凋亡通路从而抑制胃癌细胞凋亡。最后，将已分别感染ARK5-RNAi、Pim-3-RNAi的人胃癌SGC7901细胞注射入裸鼠皮下，检测平均肿瘤体积、肿瘤微血管密度、VEGF蛋白表达情况，结果发现基因沉默ARK5、Pim-3均可抑制肿瘤的生长。综上所述，本课题的完成证实了ARK5/p38MAPK/Pim-3信号通路在胃癌发生、发展中的关键作用。