长角血蜱中肠副肌球蛋白基因表达、免疫原性及功能分析

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites, and transmit many diseases, causing heavy damage to human health and livestock. Tick control is principally dependent on the application of acaricides. However, it can develop resistance to acaricides for ticks and raises environmental contamination. So, more and more researches have been focused on the vaccine against ticks. Paramyosins are myofibrillar proteins，and exist in invertebrates. Meanwhile, the vertebrates don't have homologous paramyosins in the body, and it can't cause autoimmune responses. Thus, paramyosins are one of the most ideal candidate antigen for vaccine. In early stage, we successful cloned the gene of paramyosins in Haemaphysalis longicornis. In this study, we have an system research on the gene expression, protein purification and immunogenicity of paramyosin in H. longicornis, by using the method of biochemistry, molecular biology, immunology and so on. In order to identify the immune function, we will do the experiment of animal vaccination by using different kinds of Pmy vaccine. The results could be the evidence for vaccine against ticks. This study not only has important theoretical significance for revealing the mechanism of immune response in ticks, but also has practical application value for tick control.

蜱类是专性吸血的外寄生动物，传播多种疾病，给人类健康和畜牧业带来极大危害。目前控制蜱类的主要手段是使用化学杀虫剂，长期使用引起蜱的抗药性，同时造成环境污染，因此，抗蜱疫苗的研制已成为研究热点。副肌球蛋白(Pmy)是存在于无脊椎动物中的一种肌纤维蛋白，由于脊椎动物体内无此同源性蛋白，不会引起自身免疫反应，因此，它是最理想的疫苗候选抗原之一。本项目拟以长角血蜱Haemaphysalis longicornis为研究对象，在课题组前期成功克隆其Pmy基因的基础上，运用生物化学、分子生物学、免疫学等现代生物学的研究方法，对长角血蜱Pmy基因表达、蛋白纯化及免疫原性等方面进行系统研究，并将不同型式Pmy疫苗免疫接种动物，通过抗蜱实验鉴定其功能。研究结果为制备抗蜱疫苗提供依据，对于揭示蜱类免疫应答机制以及蜱类防治具有重要的理论意义和实际应用价值。

蜱类是专性吸血的外寄生动物，传播多种疾病，给人类健康和畜牧业带来极大危害。副肌球蛋白(Pmy)是存在于无脊椎动物中的一种理想的疫苗候选抗原之一。本项目以长角血蜱为研究对象，运用生物化学、分子生物学、免疫学等现代生物学的研究方法，对长角血蜱Pmy基因表达、蛋白纯化及免疫原性等方面进行系统研究，并将不同型式Pmy疫苗免疫接种动物，通过抗蜱实验鉴定其功能。主要得到以下结论：.（1）通过含有酶切位点（EcoRⅠ和NotⅠ）的特异性引物PCR扩增Pmy基因，将其与pET-32(a+)分别双酶切，经T4连接转入大肠杆菌BL21中进行原核表达，得到重组蛋白rPmy，相对分子量约为120 kDa。通过改变IPTG浓度、诱导温度及时间，优化得出rPmy在25℃，0.5 mmol/L IPTG诱导6h的菌液上清中表达量最高。（2）将诱导后菌株上清液过亲和层析柱，咪唑梯度洗脱收集rPmy，SDS-PAGE电泳结果显示，随着咪唑浓度的升高，rPmy纯度逐渐增大，且500 mmol/L咪唑浓度纯化的rPmy纯度最高。Western Blot结果显示，120 kDa处的重组蛋白rPmy可与兔抗长角血蜱血清结合，表明rPmy蛋白具有免疫原性。（3）人工合成Pmy抗原决定簇序列LEEAEGSSETVVEMNKKRDTE，将其命名为LEE，并通过化学合成多肽抗原KLH-LEE。将Pmy基因双酶切与pcDNA3.1连接，构建得到重组真核质粒pcDNA3.1-Pmy。之后，将重组蛋白rPmy、多肽抗原KLH-LEE和重组真核质粒pcDNA3.1-Pmy分别免疫注射新西兰大白兔。蜱叮咬实验结果表明，与对照组相比，rPmy实验组和KLH-LEE实验组均可显著降低雌蜱的饱血体重、产卵量及卵的孵化率（P<0.05），pcDNA3.1-Pmy实验组可显著降低雌蜱饱血体重、产卵量（P<0.05）。统计分析结果表明，不同处理组（rPmy、KLH-LEE和pcDNA3.1-Pmy）免疫保护力分别为74%、76%、60%，且前两者显著高于pcDNA3.1-Pmy实验组（P<0.05）。三者相比，多肽疫苗KLH-LEE组防治效果更好些。.以上研究成果为制备抗蜱疫苗提供依据，对于揭示蜱类免疫应答机制以及蜱类防治具有重要的理论意义和实际应用价值。