Ascl2转录激活Lgr5表达维持Lgr5+胃癌干细胞自我更新的分子机制研究

Self-renewal of gastric cancer stem cells (GCSCs) was recently recognized as the driving force of malignant growth in gastric cancer. But the reported GCSCs marker CD44 was not fully sufficient in isolating the self-renewing GCSCs. We demonstrated in our previous work that Lgr5+ gastric cancer cells possessed self-renewing capacity, with transcription factor Ascl2 as a key regulator. In the present project, the underlying mechanism of action of Ascl2 in self-renewal of GCSCs is to be investigated. In intestinal stem cells (ISCs) of Ascl2 transgenic mouse, overexpression of Lgr5 was found. Lgr5 was a newly identified Wnt co-receptor which maintained development of ISCs through activating canonical Wnt pathway. Bioinformatic screening of Lgr5 promoter showed several candidate binding sites for Ascl2. Our preliminary data showed that Ascl2 knockdown reduced self-renewing capacity as well as Lgr5 expression in Lgr5+ GCSCs. Based on these data, we hypothesize that Ascl2 maintained self-renewal of Lgr5+ GCSCs by upregulating Lgr5 expression at transcriptional level. We plan to explore the role of Ascl2 and Lgr5 in self-renewal by a conditional expression lentiviral system for delivering respective shRNA in Lgr5+ GCSCs. Transcriptional regulation of Lgr5 Ascl2 was investigated using chromatin immunoprecipitation (CHIP), Electromobility Shift Assay (EMSA), and luciferase reporter assay. This project may shed light on the molecular and cellular mechanisms of malignant growth in gastric cancer and provide novel target for inhibiting self-renewal of GCSCs.

胃癌恶性生长的动力源自胃癌干细胞（GCSCs）的自我更新，我们发现Lgr5+胃癌细胞具有GCSCs的特性，且转录因子Ascl2是维持其自我更新的关键基因，但Ascl2发挥作用的具体分子机制不详。生物信息学预测提示Lgr5启动子区有多个Ascl2潜在结合位点；预实验表明下调Ascl2表达导致GCSCs的Lgr5表达和自我更新均显著降低。因此本项目提出假说：Ascl2可能通过转录激活Lgr5表达，维持Lgr5+ GCSCs自我更新。拟采用可诱导调控慢病毒载体等方法体内/外、定时/量地上/下调Ascl2和Lgr5表达、检测Ascl2-Lgr5通路在Lgr5+ GCSCs自我更新中的作用；采用CHIP、EMSA、萤光素酶报告基因实验探讨Ascl2调控Lgr5表达的分子机制。研究结果有望为针对GCSCs抑制胃癌恶性生长的治疗策略提供潜在的干预靶点和实验依据。

肿瘤细胞群体的遗传特性和生物学行为具有极大异质性，其中一小群具有干细胞样特性的肿瘤细胞称为肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSC）。CSC在包括胃癌和肝癌在内的多种肿瘤发生发展中发挥重要作用，但是胃癌和肝癌CSC促进肿瘤恶性演进的分子机制尚不明确。最近研究显示，Lgr5+肠道上皮细胞在胃肠道黏膜再生修复中发挥重要重要，Lgr5也在一些肿瘤组织中异常表达，但Lgr5+肿瘤细胞的生物学特性尚不清楚。本项目研究Lgr5+胃癌和肝癌CSC的生物学特性，探讨转录因子Ascl2调控Lgr5+ CSC自我更新中的作用机制。.本项目获得如下研究发现：1. 发现Lgr5+胃癌细胞和肝癌细胞具有肿瘤干细胞（CSCs）生物学特性；2. 发现Ascl2调控Lgr5+CSC自我更新的自我更新能力；3. 证实Lgr5+CSC具有高侵袭特性，且高表达的Ascl2促进Lgr5+CSC自我更新；4. 发现Ascl2不能显著调控胃癌细胞侵袭相关分子Lgr5的蛋白表达水平；5. 从分析转录因子Ascl2调控的基因表达谱和基因组的结合位点，以及Ascl2相互作用蛋白为切入点，综合分析，探讨Ascl2调控胃癌细胞自我更新的可能分子机制；6. 证明Lgr5+CSC的干性特征受组蛋白去甲基化酶LSD1激活的β-catenin信号通路所调控；7. 证明组蛋白去甲基化酶LSD1对肿瘤细胞侵袭特性的调控作用；8. 开发了一种新的基于5/35嵌合型腺病毒新型高效靶向CSCs的基因治疗策略。.基于上述研究成果，本项目在《Oncogene》（IF: 8.459）等国际肿瘤研究权威期刊发表高影响力SCI论文共3篇，累计影响因子超过14分。综上所述，这些研究成果进一步阐明了CSC自我更新的机制，发现了潜在的分子治疗靶标，为靶向CSC抑制肿瘤侵袭转移提供了新的治疗策略，具有较好的科学价值和临床意义。