casein kinase I alpha在卵母细胞减数分裂成熟和克隆胚胎发育中对染色体分离作用的研究

蛋白激酶及其耦联的信号通路在卵母细胞成熟、早期胚胎发育和细胞重编程过程中发挥着重要的作用。有一类蛋白激酶，即酪蛋白激酶及其相关通路还未得到充分的研究。我们的初步研究结果已经表明酪蛋白激酶家族的一个重要成员casein kinase I alpha（CK1 alpha）在卵母细胞减数分裂过程中和染色体的定位具有紧密的联系。同时，我们还发现体细胞克隆胚胎早期发育过程中此种蛋白激酶严重缺失。从这些结果中我们可以初步断定，CK1 alpha与卵母细胞成熟、克隆胚胎的早期发育染色体分离过程有紧密的关系。但其发挥作用的机理和它的上下游信号调节机理还有待于我们去探索。本课题旨在利用免疫组化、免疫沉淀、siRNA干涉和抑制剂处理等多种细胞学和分子生物学的方法来探讨CK1 alpha的定位、发挥作用的机制以及相关的信号通路，阐明它在染色分离过程中的作用，揭示染色体分离规律。为细胞周期的研究提供思路。

Casein kinase 1 alpha (CK1α)是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族成员，普遍存在于真核生物中。在哺乳动物有丝分裂过程中，CK1α调节细胞从间期到中期的转换。但其在哺乳动物卵母细胞减数分裂中的作用还不清楚。本研究收集GV、GVBD、MI、AI-TI、MII和受精后AII-TII、早原核期（PN）、1-细胞晚期(Late 1-c) 8个时期的小鼠卵母细胞和早期胚胎，利用RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光技术检测CK1α 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的表达变化及定位。结果显示，CK1α在减数分裂中期的表达量较高，并且从GVBD期到Late1-c始终与凝集的染色体共定位。为了进一步研究CK1α在减数分裂过程中的作用机理，我们运用功能缺失的方法，向卵母细胞中注射Morpholino连接的特异敲减CK1α的RNA干扰片段，检测CK1α的表达、定位以及对卵母细胞减数分裂的影响。结果显示，注射后CK1α的蛋白水平明显下降，并且在MII时期染色体发生错排，中期板增厚。进一步使用CK1特异的抑制剂D4476在卵母细胞培养过程中抑制其活性，结果显示，卵母细胞无法正常成熟，并伴有大极体排出，大部分卵母细胞停滞在pro-MI期，且染色体中期板形成失败。使用D4476处理的卵母细胞进行体外受精发现，受精率和胚胎发育率显著低于对照组。最后，通过使用CK1α的变构激活剂pyrvinium pamoate (PP)来过度增强其活性。结果显示，CK1α的异常激活导致卵母细胞第一极体排放失败并出现了染色体过度凝集、染色体错排的现象。. 综上所述，本研究通过在小鼠卵母细胞成熟以及早期胚胎发育过程中分析CK1α表达、定位，并对其功能进行干扰，较系统的探讨了该激酶在减数分裂过程中的作用，证明了CK1α作为一种重要的细胞分裂调控因子，在卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中对染色体排列和同源染色体分离过程中起到重要作用。