伤寒沙门菌yncD基因参与铁摄取的功能研究

Iron is an essential element for bacterial survival. For Gram-negative bacteria, the transportation of siderophores across outer membrane is mediated by TonB-dependent transporter (TBDT). Previous studies have shown that these TBDTs play a key role in bacterial survival and pathogenesis in vivo. In our previous study of Salmonella Typhi, we screened and identified a noval virulence gene, yncD gene. Deletion of yncD gene led to significant decrease in survival ability and virulence of S. Typhi. Bioinformatics analysis of YncD revealed typical structural features of TBDT. A ferric iron growth-promoting experiment in iron-limited media preliminarily confirmed that the YncD involves in bacterial iron uptake. Based on these works, in this project, we intend to verify the function of yncD gene by performing experiments of radioactive iron uptake, isolation and identification of its siderophore substrate and analyzing the interaction of YncD and TonB. And we also intend to analyze the role that YncD play in the pathogenesis of S. Typhi. The results of our research will provide new ideas for the understanding of typhoid pathogenesis and lay a foundation for the future application of yncD gene in developing typhoid vaccine.

铁是细菌赖以生存的必需元素。革兰阴性菌主要通过释放铁载体从环境中竞争获取铁元素，结合了铁的铁载体向细菌胞内转运铁时需要外膜上TonB依赖性转运蛋白（TBDTs）介导， TBDTs对病原菌在体内的生存和致病至关重要。课题组在前期研究中，筛选并鉴定了一个新的伤寒沙门菌毒力基因yncD，将其敲除后会导致细菌在小鼠体内的生存能力和毒力显著降低低。生物信息学分析显示YncD具有典型的TBDT结构特征，三价铁促生长实验也初步证实yncD基因与铁摄取有关。为深入探讨yncD基因的功能，本项目拟在构建了yncD基因敲除株和回补株的基础上，进一步通过放射性铁元素摄取实验、YncD依赖性铁载体的分离鉴定，以及YncD与TonB蛋白的相互作用及其作用位点分析等研究揭示YncD在伤寒沙门菌铁摄取和致病过程中的作用，为深入认识伤寒沙门菌的铁摄取机制及致病机理奠定理论基础，并为伤寒新型减毒疫苗的研制提供新的靶标。

铁是细菌赖以生存的必需元素。革兰阴性菌主要通过释放铁载体从环境中竞争获取铁元素，结合了铁的铁载体向细菌胞内转运铁时需要外膜上TonB依赖性转运蛋白（TBDTs）介导， TBDTs对病原菌在体内的生存和致病至关重要。课题组在前期研究中，筛选并鉴定了一个新的伤寒沙门菌毒力基因yncD，将其敲除后导致细菌在小鼠体内的生存能力和毒力显著降低。生物信息学分析显示YncD具有典型的TBDT结构特征。为深入探讨yncD基因的功能，本项目主要通过贫铁培养基生长实验、原子发射光谱测定、YncD依赖性铁载体的鉴定、细胞模型分析胞内生存能力、YncD免疫保护效果等研究揭示YncD在伤寒沙门菌铁摄取和致病过程中的作用。课题组在前期构建的yncD敲除株和回补株基础上，构建了iroN-fepA-cirA三基因敲除株、foxA敲除株，采用贫铁TMM培养基比较了各菌株的生长情况，结果显示yncD 敲除株在贫铁环境中生长较野生株显著缓慢，证实YncD与铁摄取功能相关；同时各敲除株之间没有显著差异，表明YncD对细菌铁摄取能力的贡献与其他转铁蛋白类似。采用THP-1细胞模型证实yncD敲除株在胞内的生存能力显著下降，说明YncD作为一个摄铁蛋白，其在伤寒沙门菌胞内生存乃至致病过程中发挥了重要作用。我们进一步将YncD重组表达，以小鼠动物模型做了免疫保护实验，初步结果显示YncD蛋白具有良好免疫保护效果。通过本课题的研究我们证实了最初的假说，即YncD是一个摄铁相关转运蛋白，证实其功能与细菌体内生存能力密切相关。由于蛋白位于细菌表面，是良好的蛋白疫苗候选。. 本课题基本达到研究目的，且为后续YncD作为组分疫苗的应用奠定了理论基础。本项目到目前为止共发表相关SCI论文2篇，获国家发明专利授权1项