非编码RNA调控PxGSTu1介导小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制

The diamondback mot, Plutella xylostella(L), is an important pest of cruciferous plants worldwide. Due to the long-term chemical control, P. xylostella has developed resistance to a variety of chemical insecticides, including chlorantraniliprole. Previously, we have preliminarily confirmed that PxGSTu1 is involved in chlorantraniliprole resistance in P. xylostella by using transcriptome sequencing and RNAi. In addition, an antisense lncRNA (lncRNA-GSTu1-AS) and several microRNAs were also identified, and they were speculated to be involved in the regulation of PxGSTu1 expression, but the mechanism of action is still unclear. Therefore, on the basis of previous studies, the role of PxGSTu1 in chlorantraniliprole resistance would be further determined by using CRISPR/Cas9 technology in this study. Then, we would focus on the regulation of PxGSTu1 expression through lnc-GSTu1-AS and miRNAs, and elucidate the mechanism of non-coding RNAs in chlorantraniliprole resistance. The results are helpful to improve the theory of insect toxicology, and of practical significance for the effective control of chlorantraniliprole resistance P. xylostella.

小菜蛾是世界范围内十字花科类植物的重要害虫。由于长期依赖化学防治，小菜蛾已经对包括氯虫苯甲酰胺在内的多种化学杀虫药剂产生了不同程度的抗性。前期通过转录组测序、RNAi等方法，我们已经初步证实PxGSTu1参与介导了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性；此外，我们还鉴定到了一条反义lncRNA（lncRNA-GSTu1-AS）及多条miRNAs，初步判定它们可能参与了PxGSTu1的表达调控，但具体的作用机制仍不清楚。因此，本项目拟在前期研究的基础上，首先通过CRISPR/Cas9技术敲除PxGSTu1，进一步确定PxGSTu1在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性中的作用；然后以PxGSTu1为切入点，重点研究lnc-GSTu1-AS和miRNA对其表达的调控机制，进而阐明非编码RNA在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性中的作用机制。研究结果对于完善昆虫毒理学理论及有效治理氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾具有积极的理论和实践意义。

小菜蛾，Plutella xylostella (L.)，是世界十字花科类作物的重要害虫。化学防治是目前控制小菜蛾的最有效手段，但由于化学农药长期、大范围的不合理使用，小菜蛾已对90多种不同成分的杀虫剂 （包括氯虫苯甲酰胺） 产生了抗药性，成为世界上抗药性最严重的农业害虫之一。昆虫对杀虫药剂的抗性与解毒酶的过量表达密切相关。尽管谷胱甘肽S-转移酶（GST）在杀虫剂抗性中的作用已被广泛报道，但其潜在的调控机制尚不清楚。在这里，我们鉴定并克隆了一个GST基因（GSTu1）及其反义转录物（lnc-GSTu1-AS），并且这两个基因都在小菜蛾氯虫苯甲酰胺抗性品系中显著上调表达。前期，我们已经证实GSTu1可以直接降解代谢氯虫苯甲酰胺。通过本项目的研究，我们发现1）反义lnc-GSTu1-AS在小菜蛾体内可以与GSTu1互补结合，进而维持GSTu1的稳定性。2）miR-8525-5p和 miR-8530-5p在小菜蛾氯虫苯甲酰胺抗性品系中表达量升高，并且可以作用于GSTu1。3）单独抑制或过量表达miR-8525-5p和miR-8530-5p，对GSTu1的表达和小菜蛾氯虫苯甲酰胺的抗性无显著影响；单独干扰lnc-GSTu1-AS，可显著地降低GSTu1的表达量，并降低小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。4）在氯虫苯甲酰胺抗性品系中，抑制miR-8525-5p的表达，并同时干扰lnc-GSTu1-AS，可使GSTu1的表达量维持在一个较高水平，并维持小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性水平。综上，本研究发现lnc-GSTu1-AS通过阻止miR-8525-5p可能诱导的GSTu1降解来维持GSTu1的mRNA稳定性，从而增加了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。通过本项目的研究创新性的揭示了一种新的非编码RNA调控昆虫抗药性相关解毒酶基因表达的分子机制，并为进一步了解昆虫抗药性的调控机制奠定了基础。研究结果共发表SCI论文1篇，培养硕士研究生2名。