甘草与天然β2受体激动剂治疗哮喘的协同作用机理研究

我国中医治疗哮喘的历史十分悠久，积累了丰富的临床经验，但哮喘的用药市场现仍以西药为主，中药占有率很低。原因之一就是对中药疗效机理方面的研究不够深入，中药复方发挥作用的有效成分、作用途径和靶点等尚不清楚。本项目从研究中医治疗哮喘的药效成分的配伍机制入手，采用甘草酸和麻黄碱对炎性介质诱导的人支气管平滑肌细胞进行干预，通过基因芯片技术结合生物信息学方法分析相关基因表达的差异，并通过RT-PCR，real time PCR，Western blot以及ELISA等方法进行确认。从分子生物学、细胞生物学、分子药理学等各个不同角度，通过信号传导、离子通道、受体功能分析以及细胞凋亡等研究手段，系统地分析甘草与天然β2受体激动剂之间的协同作用关系，阐明其内在的分子机制，破解中医咳喘配伍机制的秘密，澄清甘草经信号传导、离子通道途径发挥作用，充当"使药"的科学内涵，为天然咳喘药物的研发及临床应用奠定理论基础。

由于哮喘致病网络的复杂性，人们意识到针对单一的靶标并不能有效地治疗此类复杂疾病，并且直接针对主要功能节点和通路的干预有时也会引起较强的毒副作用。引入中药的多组分、多靶点、多途径的治疗理念可能是解决此类问题的方法之一。甘草具有中和之性，调和诸药之功，出现在很多治疗呼吸系统疾病的经典方剂中。本课题的目的就是研究甘草与天然β2肾上腺素受体（β2-AR）激动剂合用时协同增效的作用机制。我们首先建立了一种UPLC/Q-TOF-MS结合双荧光素酶报告基因系统的筛选方法，从中药材和中成药中筛选、鉴定天然的β2-AR激动剂。选取代表性的天然β2-AR激动剂-麻黄碱和甘草中的主要活性成分-甘草酸作为研究对象，利用基因芯片技术考察了两者干预细胞前后相关基因表达的差异。结果发现甘草酸介导的基因表达变化主要集中在信号转导、受体磷酸化调节、离子通道、细胞凋亡等方面，为系统全面地了解β2-AR激动剂和甘草酸的协同作用机制提供了线索。随后我们采用多种生物学实验方法证明了：（1）甘草酸通过调节Bcl-2/Bax mRNA比率，可以对β2-AR激动剂诱导的早期凋亡起到抑制作用；（2）甘草酸可以抑制β2AR激动剂引起的β2AR在胞浆内形成的颗粒聚集，降低β2-AR的磷酸化程度，阻断β-arrestins以及笼型蛋白和β2-AR的结合，抑制受体内化，稳定细胞膜表面β2-AR的数量，保护受体的功能；（3）甘草酸对β2-AR激动剂、G蛋白激动剂、AC激动剂具有不同程度的协同增效作用，但不能逆转特异性β2-AR拮抗剂对受体的拮抗作用，证明β2-AR的激活是必不可少的前提条件，推测甘草次酸的协同作用与β2-AR的激活有直接的关系。为了揭示甘草酸的作用靶点，我们合成了可用于荧光标记的甘草次酸叠氮化衍生物及荧光探针。通过点击化学的荧光示踪技术，结合激光共聚焦显微镜的观察和蔗糖密度梯度离心技术，我们发现甘草次酸可以与胆固醇竞争性地结合在细胞膜的脂筏区，通过降低细胞膜胆固醇的密度，改变细胞膜内侧的流动性，使β2-AR由非活化状态转变成活化状态。由于处于活化状态的β-2AR数量增加，当β-2AR激动剂加入时导致cAMP的产量增加，因此信号的级联放大的效率增加。本研究结果阐明了甘草与β-2AR激动剂协同增效的科学内涵，也为揭示甘草调和诸药充当“使药”的分子机制提供了重要线索。