蛋白激酶PAK5在骨肉瘤多药耐药中的功能及分子机制研究

骨肉瘤是好发于青少年的原发性恶性骨肿瘤，目前的治疗主要是以手术和化疗为主的综合治疗。骨肉瘤细胞对化疗药物产生多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一。本课题组在前期工作中建立了骨肉瘤多药耐药细胞株MG-63/DXR，并对不同骨肉瘤组织样本进行肿瘤细胞的原代培养，获得了对化疗敏感的原代细胞株和不敏感细胞株；应用基因芯片分析骨肉瘤多药耐药细胞及敏感细胞基因表达谱的差异，发现p21活化激酶家族（p21-activated kinase，PAKs）可能与多药耐药的形成有关，其中尤以PAK5基因表达的改变最为显著，抑制PAK5的表达能够显著改善MG-63/DXR细胞对于阿霉素的敏感性。目前PAK5与肿瘤细胞多药耐药的关系尚未见报道。本项目拟通过体内外实验进一步验证PAK5对骨肉瘤多药耐药的影响，并探讨其相关的分子机制。同时收集骨肉瘤组织样本，回顾性分析PAK5基因表达与临床骨肉瘤化疗耐药的相关性。

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，在局部呈侵袭性生长并容易发生远处转移。p21活化激酶5（p21-activated kinase 5，PAK5）为PAKs家族中新近发现的成员，在细胞骨架重组、细胞生长、增殖、分化以及凋亡等一系列功能中发挥重要作用。近年有研究发现PAK5参与了胃癌、肠癌等肿瘤的发生发展，但PAK5在骨肉瘤中的生物学功能尚不明确。本研究的目的是通过体内外实验探索PAK5对骨肉瘤生物学行为（如侵袭转移、多药耐药等）以及患者预后的影响，并探讨其相关的分子机制。本研究首先设计并化学合成了siRNA抑制PAK5的表达，发现显著上调MG-63/DXR 细胞对于阿霉素、顺铂、异环磷酰胺的敏感性。回顾性分析新辅助化疗骨肉瘤患者PAK5表达与化疗敏感性的关系，发现瘤组织过表达PAK5的患者肿块退缩不足25%，初步证实PAK5与肿瘤耐药密切相关。PAK5在骨肉瘤组织和细胞系中过表达，进一步构建shRNA-PAK5病毒载体，转染骨肉瘤Saos-2细胞株，发现其增殖和集落形成能力被显著抑制，凋亡显著增加，同时小鼠移植瘤模型证明其肿瘤形成能力显著下降。肿瘤细胞抗凋亡是触发瘤细胞多药耐药的重要机制，本研究体内外实验均证实，干扰PAK5表达显著诱导了骨肉瘤细胞凋亡，这可能是PAK5影响骨肉瘤细胞耐药的机制。本研究回顾性分析PAK5基因表达与临床预后的相关性，发现PAK5与骨肉瘤化疗耐药、肺转移均密切相关，骨肉瘤组织高PAK5表达与更短的总体生存率相关。肺是骨肉瘤最常见的转移部位，我们进一步实验证明，敲除PAK5后骨肉瘤细胞侵袭能力显著下调，并发现MMP-2在PAK5沉默后也显著下调。回顾性分析发现PAK5表达在肺转移组织中比原发骨肉瘤组织中更高，高表达PAK5的组织MMP-2表达水平也升高。研究还发现肿瘤大小、分期、局部复发、肺转移及PAK5表达水平是影响骨肉瘤预后的因素，且PAK5高表达能降低化疗有效率。多因素分析显示PAK5表达水平及肺转移是影响骨肉瘤预后的独立因素。本研究还进一步探索了逆转骨肉瘤多药耐药(MDR)的机制，应用西罗莫司联合细胞毒药物处理MG63/DXR细胞，发现西罗莫司可逆转MDR，通过miRNA microarray、原位杂交等分析，揭示西罗莫司通过上调miR-34b，负调控PAK5同源蛋白PAK1和ABCB1的表达，从而逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。