利用高通量系统生物学方法研究2型糖尿病遗传风险的分子机制

For the last decade, GWAS has identified approximately 120 risk loci associated with predisposition of type 2 diabetes (T2D). Dissecting the molecular mechanism of these SNPs (single nucleotide polymorphisms) has proven challenging as very few of them alter amino acid sequence of any protein. In this project, we plan to use the following strategies to systematically test the function of type 2 diabetes GWAS hits: 1) using HT-SELEX to investigate the differential binding affinities of 10 known T2D relevant transcription factors (TFs) to two alleles of ~5000 SNPs that are in linkage disequilibrium (LD) with the 120 GWAS hits; 2) using STARR-seq to test the imbalanced enhancer activity of the 5000 SNPs in T2D associated cell types, mainly HepG2 and MIN6 cell lines; 3) using Hi-C to call chromatin loops in HepG2 and MIN6 and associate functional SNPs with target genes. We expect to identify tens to hundreds of SNPs that can affect TF binding affinity and enhancer activity in respective cell types and assign them to target gene expression. We can test the function of a few of these positive SNPs in vivo. These data provide molecular mechanism of T2D risk SNPs and will be a valuable resource for clinical use, such as early genetic assessment of T2D risk or improving treatment strategy for T2D patients.

在过去十年中，GWAS确定了大约120个与2型糖尿病易感性相关的风险位点，由于这些位点多位于非编码区，确定这些单核苷酸多态性（SNP）的分子机制却十分困难。在本研究课题中，计划通过以下方法来系统地研究2型糖尿病GWAS风险位点的分子机制：1）使用HT-SELEX研究10个与T2D相关转录因子与SNP等位基因的差异结合亲和力。我们选择与120个GWAS SNP处于连锁不平衡的5000个SNP作为研究对象; 2）利用STARR-seq检测这5000个SNPs在T2D相关细胞类型中对增强子活性的影响，主要包括HepG2和MIN6细胞系; 3）使用Hi-C解析HepG2和MIN6中的染色质长距离相互作用，并将功能性SNP与靶基因相关联。我们期望通过以上研究，系统地找出GWAS SNP的分子机制。这将为提高2型糖尿病遗传风险评估的准确性和改善患者治疗方案等临床应用提供重要的理论依据。

中国是世界上糖尿患者最多的国家，约有1.1亿人口患有糖尿病（约占我国成年人口总数的10%）。糖尿病已成为威胁我国人民健康、社会和经济发展的主要因素之一。双胞胎研究显示，2型糖尿病的发生与家族病史有着密切的联系，遗传因素约占30-70%。在过去的十年中，全基因组关联分析（GWAS）确定了约120个影响2型糖尿病风险的基因位点（risk loci）。但是，从发现这些风险位点到明确发病机制仍然存在较大挑战，因此GWAS在机理发现和医疗转化上的意义备受质疑。为了实现全面系统地分析2型糖尿病风险SNP的分子功能，找出其遗传因素的分子机理，我们从以下三个方面开展了研究工作：1）利用SNP-SELEX量化SNP对代谢中发挥重要作用的270个转录因子结合力的影响；2）通过报告基因实验，分析SNP在2型糖尿病相关细胞类型（主要包括肝脏和肠道细胞）中对增强子活性的影响；3）利用Hi-C分析，确定SNP在相关细胞类型中的目标基因；4）通过CRISPR/Cas9敲除含有SNP的基因组片段以及通过siRNA降低对应转录因子的表达，进一步研究它们在能量代谢和2型糖尿病中的作用。其中，我们发现风险SNP rs7118999通过调节肝细胞中载脂蛋白CⅢ的表达，影响了脂肪的转运与代谢；风险SNP rs2643219可以调节细胞葡萄糖转运效率，它的突变会导致葡萄糖吸收效率下降，而产生胰岛素抵抗；而SNP rs10811660主要调节胰岛素受体细胞衰老与增值，影响机体对胰岛素的敏感性。这些发现一方面从生化属性上明确了转录因子与SNP的直接相互作用，量化了SNP的分子功能；另一方面通过在体内关联SNP下游靶基因，系统阐释了2型糖尿病遗传因素的分子机制，对于提高2型糖尿病临床早期检测的准确性和优化治疗方案提供了重要理论依据，具有重要的临床转化潜力。