miRNA与FOXO转录因子相互作用调控家鸡肌肉生长的机制研究

In our previous study, we have identified the differentially expressed miR-16, miR-223 and their common targets (FOXO transcription factor genes) in muscle tissues from different chicken breeds. Based on previous research foundation during chicken myoblast growth, in this project, we firstly identify all regulatory target genes for miR-16 and miR-223, and determine the interactions between these two miRNA and FOXO transcription factor by use of some advanced technology including high-throughput sequencing in cell culture,co-transfection and proteome quantitative analysis, et al. Moreover, we further analyze the effects of FOXO1 and FOXO3 in regulating miRNA and mRNA at transcriptional level and the interaction network during chicken myoblast growth process through chromatin immunoprecipitation (ChIP) technology. Finally, some key miRNA and encoding genes within the network are selected for variation and marker-trait association analysis, so as to reveal the genetic effects of these genes on growth and to identify effective molecular markers for broiler growth. In summary, in this project, we aim to construct the interaction network among regulatory miRNA and FOXO transcription factors in chicken myoblast, and systematically reveal the molecular regulatory mechanism of miRNA and FOXO transcription factors in regulating muscle growth in domestic chickens.

项目组前期在鸡肌肉组织中筛选出品种间差异表达的miR-16和miR-223，以及它们共有的靶基因FOXO转录因子。本项目在此基础上，构建miR-16和miR-223过表达/抑制表达的鸡成肌细胞模型，通过细胞水平高通量测序、细胞共转染、蛋白质组定量分析等先进技术鉴定肌肉生长过程中的靶基因及其功能，并揭示miRNA与FOXO转录因子之间的相互作用。其次，利用染色质免疫共沉淀等技术研究鸡成肌细胞生长过程中FOXO1和FOXO3等转录因子对mRNA及miRNA的转录调控和作用网络。最后，针对调控网络中关键性miRNA和编码基因进行遗传变异和标记性状关联分析，进一步揭示它们对生长的遗传效应和筛选出与肉鸡生长性状显著关联的有效分子标记。综合以上，本项目将系统构建调控性miRNA与FOXO转录因子在肌肉细胞中的相互作用网络，全面解析miRNA和FOXO转录因子对家鸡肌肉生长的分子调控机制。

产肉性能是肉鸡生产最有经济意义的性状之一，围绕该性状已经开展了大量的研究工作，但对于QTL区间的致因性突变的挖掘和主效基因的功能调控机制的研究仍然不十分清楚。在此背景下，本项目基于课题组前期的工作基础，分别选取QTL区间内的miR-16和miR-223作为影响生长和肌肉沉积的主效候选基因进行功能基因组学研究，重点解析miR-16和miR-223在鸡肌肉生长中的分子调控机制。主要研究结果如下：.（1）通过功能验证实验，分别验证了miR-16和miR-223在骨骼肌生长发育中的功能。miR-16基因的前体序列上游145bp处存在54bp的插入突变，该插入片段与肉鸡的体重、胸肌重和腿肌重均极显著关联。过表达miR-16抑制成肌细胞的增殖，促进成肌细胞的凋亡。miR-223在肌肉细胞分化和融合的活跃期上调表达，在肌纤维成熟期下调表达。miR-223抑制成肌细胞的增殖和促进成肌细胞的分化。.（2）通过靶标实验，验证了miR-16和miR-223的关键性靶基因。其中，FOXO1和Bcl2是miR-16的靶基因，miR-16通过直接抑制Bcl2和FOXO1的活性，控制成肌细胞的增殖和凋亡。IGF2和ZEB1是miR-223的靶基因，miR-223对IGF2和ZEB1的抑制作用在成肌细胞的增殖及分化过程具有差异。.（3）系统分析FOXO1的转录调控结合区域，获得5个FOXO1 的下游调控编码基因，包括BCL6，JAK2，TGFBR2、TAB1和GRB2，FOXO1可与这些基因的TSS位点结合。.（4）构建了miR-16和miR-223及其靶基因的互作调控网络。miR-16通过靶向FOXO1和Bcl2，从而调控成肌细胞的增殖和凋亡。miR-223通过靶向IGF2和ZEB1，从而调控成肌细胞增殖和分化。.（5）鉴定出与肉鸡生长相关的重要候选基因和miRNA，候选基因包括：FOXO1、FOXO3、Bcl2、IGF2、ZEB1；miRNA包括：miR-16、miR-223、miR-206、miR-133a-5p和miR-29b-1-5等。.综上所述，本项目进一步解析了miR-16和miR-223在鸡成肌细胞生长分化过程中的分子调控机制，并获得了几个与鸡肌肉生长相关的有效分子遗传标记。