R-spondin2在人多能干细胞造血分化中的功能和作用机制研究

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into hematopoietic stem/progenitor cells and functional blood cells. However, the efficiency of hematopoietic differentiation is low and the generation of RBCs and Platelets on a clinical scale and hematopoietic cells with robust and sustained multi-lineage engraftment have not been achieved. Elucidating the mechanism regulating hematopoietic differentiation from hPSCs is critical in solving these problems. Our preliminary data suggested that R-spondin2 promoted hemogenic endothelium and hematopoietic stem/progenitor cells development from hPSCs. These results indicated that R-spondin2 might play important roles in regulating the process of hPSCs differentiating into hematopoietic cells. In this study, we will dissect the stage-specific function of R-spondin2 in hPSCs hematopoiesis and its potential effect on definitive hematopoiesis. Furthermore, the potential downstream targets of R-spondin2 will be explored by using RNA-SEQ and CRISPR/Cas9 technology. Our results will clarify the function and molecular mechanisms of R-spondin2 in regulating hPSCs hematopoietic differentiation and it might facilitate the derivation of hematopoietic cells from hPSCs with high efficiency and quality.

人多能干细胞可以分化为造血干/祖细胞和功能性血细胞。然而，现有的造血分化体系效率低，且不能够生成具有移植能力的造血干细胞，同时诱导分化产生的红细胞和血小板数量远低于临床所需输血标准。阐明人多能干细胞造血分化过程及调控机制有助于解决这些问题。我们前期研究发现R-spondin2显著促进生血内皮细胞和造血祖细胞的产生，提示R-spondin2可能在人多能干细胞造血分化过程中具有重要作用。本研究将进一步揭示R-spondin2在人多能胚胎干细胞造血分化的作用及其发挥作用的窗口期，同时探索其对成年造血的影响，并利用RNA-SEQ技术和CRISPR/Cas9技术阐明其作用机制，加深人们对人多能干细胞造血分化过程及调控机制的理解，为建立高效、高质造血分化体系提供理论依据。

人多能干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，为体外产生功能血细胞满足临床输注需求提供了潜在来源。但是，目前利用人多能干细胞产生真正的造血干细胞和具有成熟功能的血细胞仍然存在效率低下和机理不明确等问题。因此加深对人多能干细胞造血分化过程中的调控机理，以及进一步优化目前分化的体系具有非常重要的意义。本研究中，我们发现具有造血分化支持能力的基质细胞高表达R-spondin2这一分泌蛋白。在造血分化过程中外源添加R-spondin2可以显著促进人多能干细胞造血分化。进一步研究R-spondin2的作用窗口，我们发现在中胚层诱导阶段的早期短暂添加R-spondin2就足以显著促进后期造血前体细胞的大量产生。与此发现一致的是，我们发R-spondin2的添加显著促进了APLNR+中胚层细胞的产生，也就是具有造血分化潜能的一群中胚层亚群。通过RNA-SEQ分析和功能验证，我们也探究了R-spondin2的作用机理。我们发现R-spondin2激活了TGF-beta信号通路，首次鉴定了R-spondin2与TGF-beta之间的调控关系。此外，本项目探究了R-spondin2的受体，并发现了受体LGR4在人多能干细胞造血分化中的重要作用。我们发现，敲除LGR4显著抑制APLNR+中胚层细胞的产生，从而抑制人多能干细胞造血分化。令人意外的是，敲除LGR4并不能阻断R-spondin2对造血分化的促进作用。通过构建LGR4/LGR5双敲的人多能干细胞株，我们也发现在人多能干细胞造血分化中LGR4而非LGR5发挥必不可少的调控作用。综上所述，本研究以人多能干细胞为模型，探讨了R-spondin2在人多能干细胞造血分化中的功能及作用机理，揭示了R-spondin2作为一个来源于造血微环境的外源因子对造血分化的促进作用，并发现了R-spondin2作用的新的下游信号通路。本研究鉴定发现了R-spondin2的重要作用，可以提高大规模生产功能性血细胞的效率，为将来转化医学的应用提供有效工具。