茶树镁离子螯合酶基因在叶绿素合成中的功能及分子机制研究

The chlorophyll biosynthesis pathway of Camellia sinensis was systematic analyzed in our previous study, the results indicated that genes of CsCHLI,CsCHLD and CsCHLH were positively correlated with the content of chlorophyll in Camellia sinensis. Interestingly, the decrease of these genes expression would hinder the synthesis of chlorophyll, which seriously affects the growth and development of Camellia sinensis as well as its yield and quality. In this project, the tea varieties of 'longjing 43' and 'huangjinya' with different chlorophyll content will be used as the materials. Based on the digging data of transcriptions from Camellia sinensis, the full-length of CsCHLI, CsCHLD and CsCHLH genes will be obtained by homologous cloning technique. Moreover, The structure and function of each gene will be clarified by bioinformatics, genetic transformation, ultrastructural observation, and biochemical measurement. Furthermore, in order to reveal the molecular mechanism of the interaction among I, D, and H subunits, the functional domain and key binding sites of each subunit will be analyzed by using bimolecular fluorescence complementation and yeast two-hybrid. The aim of this project is to provide the theories foundation for the study on the biosynthesis of chlorophyll and albion mechanism. Meanwhile, it will offer the scientific evidence for the research on germplasm innovation of Camellia sinensis.

课题组前期对茶树叶绿素合成途径基因的系统分析表明，镁离子螯合酶编码基因CsCHLI、CsCHLD和CsCHLH的表达量与茶树叶绿素含量成正相关，且其中任何一个亚基表达量的降低，均会使叶绿素合成受阻，从而严重影响茶树的生长发育、产量和品质。本项目拟选取叶绿素含量不同的龙井43和黄金芽茶树品种为实验材料，在挖掘它们转录组数据的基础上，利用同源克隆技术获得CsCHLI、CsCHLD和CsCHLH基因的全长序列。采用生物信息学和遗传转化等手段，结合叶片超微结构观察以及生理生化指标测定，阐明茶树镁离子螯合酶各亚基的结构和功能。此外，应用双分子荧光互补和酵母双杂交技术，对各亚基的功能结构域和关键结合位点进行分析，解译茶树I亚基、D亚基和H亚基之间相互作用的分子机制。通过本项目的实施，旨在为茶树叶绿素生物合成和白化机理的研究奠定理论基础，同时也为茶树种质创新提供科学依据。

特异白化茶树突变品种，其叶片中叶绿素含量减少，但氨基酸含量升高2~3倍，能极大的提高茶叶品质。因此，开展茶树叶绿素生物合成代谢机理的研究对茶树生长发育、茶叶品质和茶树白化机理的研究均有深远的意义。本项目分别以叶绿素含量正常以及白化茶树品种“陕茶1号”、“白叶1号”、“极白1号”、“黄金芽”和“黄金叶”为实验材料，对其镁离子螯合酶编码基因进行克隆，并探究了镁离子螯合酶3个亚基的互作机制。结果显示：1）不同叶色茶树叶片中叶绿素含量测定和qRT-PCR关联分析表明，茶树镁离子螯合酶中I亚基和D亚基基因表达量和叶绿素含量呈正相关；2）I亚基序列克隆和功能分析表明，在不同叶色茶树品种中存在多个碱基差异，并导致氨基酸序列发生改变，但是这些氨基酸残基的差异对其RNA二级结构稳定性影响不大，并且不影响其亚细胞定位；3）根据已公布的多个茶树基因组序列，对不同叶色茶树品种中CsCHLD序列进行克隆，可扩增出2种不同的CsCHLD转录本，表明CsCHLD基因在茶树中存在选择性剪切，因此可能具有与其他物种不同的功能；4）BiFC结果表明，在烟草中共转化NYFP-CsCHLI和CYFP-CsCHLH时，I亚基和H亚基存在互作；但是酵母双杂交实验显示，CsCHLI的N端与CsCHLH的C端存在互作，而I亚基的全长和C端并不与H亚基的C端相互作用，可能是由于在酵母菌株中，CsCHLI蛋白发生了特殊的折叠变构，从而覆盖了CsCHLI亚基N端的特异性结合位点。本研究通过基因克隆、亚细胞定位、BiFC、酵母双杂交等技术阐明了茶树CsCHLI、CsCHLD和CsCHLH的功能，解析其在叶绿素合成中的作用机理，完成了预定计划中的各项工作，取得阶段性成果和重要进展，为后续进一步明确茶树新梢白化形成机理，定向调控茶树新梢返白和复绿，改善茶叶品质，创制茶树新资源奠定坚实基础。已发表论文4篇，SCI收录论文3篇，A类学报1篇，另有1篇SCI论文处于审稿状态。