青海血蜱唾液腺内凝血因子FⅡa/FXa结合蛋白的筛选鉴定

Ticks are obligatory blood feeding ectoparasites of human beings and animals. To acquire a blood meal continuously for as long as two weeks or even longer, tick salivary glands secrete a variety of biologically active molecules to overcome haemostatic responses of the host. Identification of biologically active molecules binding to coagulation factors in the blood of their hosts and investigation of the interactions between those molecules and coagulation factors could explain the mechanism of tick anticoagulation, and it could also provide new ideas for developing novel therapeutic agents for cardio-vascular diseases and offer candidate antigens for researching anti-tick vaccines as well. Potential coagulation factor Ⅱa/factor Xa-binding proteins will be screened from a cDNA library constructed from salivary glands of Haemaphysalis qinghaiensis ticks with commercialized FⅡa (thrombin) and FXa and their corresponding antibodies or (and) chromogenic substrates as well. Recombinant proteins encoded by the screened positive clones will be expressed in Escherichia coli or Pichia pastoris and further be purified. The molecular structures and sizes will be determined by non-denaturing PAGE, protein sequencing and MS analysis. Inhibition effect of the prepared recombinant proteins on FⅡa, FXa, the tenase and prothrombinase complexes will be evaluated. In addition, a series of tests will also be carried out to analyzed the anti-coagulation and anti-tick immunization effects exhibited by the obtained proteins in vitro and in vivo. The finding of these biologically active proteins might help us to clarify the molecular mechanism of modulation of the host coagulation system by H. qinghaiensis.

蜱是人和家畜体表的一种吸血外寄生虫，为了在长达两周或更长的时间内持续吸食宿主血液，其唾液腺会分泌能够抑制血液凝固的活性分子，以阻止宿主血液凝固。发现蜱唾液腺内与宿主凝血因子相结合的生物活性分子并探讨这些分子与宿主凝血因子间所发生的相互作用，可初步阐释蜱抑制宿主血液凝固的分子机理，也可为开发新型抗凝血药物和研制抗蜱疫苗提供新的思路。本研究将利用凝血酶和凝血因子Ⅹa及其抗体或（和）生色底物筛选青海血蜱唾液腺cDNA表达文库，获得阳性克隆。在大肠杆菌或毕赤酵母内表达阳性克隆获得重组蛋白。利用非变性凝胶电泳、N末端氨基酸测序、质谱分析等手段初步确定所获重组蛋白的分子结构，体外分析重组蛋白与凝血酶和FⅩa以及凝血因子复合物间的相互作用及对它们的抑制效果。进一步通过一系列实验手段分析重组蛋白在体内外对凝血功能的影响和抗蜱免疫效果。这些生物活性分子的发现将帮助我们初步阐明青海血蜱调控宿主凝血系统的分子机理。

蜱是人和家畜体表的一种吸血外寄生虫，在蜱吸血过程中其唾液腺会分泌能够抑制血液凝固的活性分子，以阻止宿主血液凝固。发现蜱唾液腺内与宿主凝血因子相结合的生物活性分子并探讨这些分子与宿主凝血因子间所发生的相互作用，可初步阐释蜱抑制宿主血液凝固的分子机理，也可为开发新型抗凝血药物和研制抗蜱疫苗提供新的思路。本研究建立了利用凝血酶和凝血因子Ⅹa及其抗体筛选cDNA表达文库的功能筛选法。利用此方法从青海血蜱唾液腺cDNA表达文库中筛选获得74个阳性克隆。将其中的26个阳性克隆（Hq001至Hq026）的基因序列登录GenBank，获取了登录号 （MN306323至 MN306348）。生物信息学分析显示，Hq001的编码蛋白含有两个典型的Kunitz结构，其产物可能为组织因子途径抑制物2（TFPI2）；Hq002 的编码蛋白也含有两个Kunitz 结构，其产物与镰形扇头蜱的rhipilin-2类似；Hq003所编码的氨基酸序列内富半胱氨酸残基，且半胱氨酸残基以C-(4-5)X-C-(14-23)X-C-(11-16)的规律重复出现5次；Hq006-Hq010等的编码产物可能属于青海血蜱的免疫抑制蛋白p36家族成员；Hq012编码产物与已报道的基因序列同源性不高。其余阳性克隆暂未深入分析。将其中17个阳性克隆的蛋白编码区插入pET30a中构建了原核表达质粒。其中9个重组质粒在大肠杆菌中成功表达了目的蛋白，除一个重组质粒的表达产物可溶外，其余质粒表达的重组蛋白都以包涵体的形式存在。进一步建立了重组蛋白rHq002和rHq012的纯化方法。研究发现rHq002在体外能被凝血酶和FXa切割为小片段。rHq002能促进凝血酶、FXa、TF/FVIIa等水解其相应发色底物的活性。rHq012能促进凝血酶、FXa、TF/FVIIa、FXIIa、FXIa水解其相应发色底物的活性，该重组蛋白还能抑制前激肽释放酶和纤溶酶水解其发色底物的活性。两个蛋白都能延长正常人血浆APTT时间。初步的细胞生物学实验发现2个重组蛋白对人胚胎肾细胞HEK293、人非小细胞肺癌细胞A549和中国仓鼠卵巢细胞CHO等3个细胞株的生长形态、活力等生物学特性无影响。这些阳性克隆的发现及对其表达蛋白的深入研究，为阐明青海血蜱调控宿主凝血系统的分子机理奠定了基础。