ras及相关基因突变在绵羊肺腺瘤病毒内蒙株分子致病机理中的作用

绵羊肺腺瘤病（OPA)随优良品种的引进而带入，在分布上与种公羊及其后裔的分布相关联，对我国养羊业特别是良种繁育危害极大。近年来对绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白（JSRV-Eev）在本病分子发生机理的作用研究上取得了一些进展，但仍有一些重要的基础问题尚不完全清楚。本课题在以往研究的基础上，重点探索JSRV-Eev引起细胞增殖以及激活端粒酶引起细胞增殖过程中，能否导致ras及相关基因（如GAP和GEF基因）的突变；Ras蛋白、GAP和GEF蛋白一级结构的改变在OPA上游信号转导中起何作用；上述两方面的试验结果在实验动物Balb/c小鼠体内和绵羊体内的表现是否一致，即是否具有规律性。回答这些问题，有助于阐明ras及相关基因基因突变后的表达蛋白对细胞增殖信号的影响，有助于深入理解JSRV内蒙株所致OPA的分子发病机理。本项目对进一步搞清楚JSRV致瘤机理及确定相应的防控靶点，具有重要的理论意义和应用价值。

制备质粒pcDNA-Env-LTR、pcDNA-Env、pcDNA-SU和pcDNA-TM，分别转染NIH 3T3细胞系和自建的NIH 3T3-Hyal2-HA细胞系。结果发现：7天后Env以及SU和TM共转染组各自引起NIH 3T3细胞转化；TM诱导NIH 3T3-Hyal2-HA细胞形成明显聚积灶；pcDNA-TM诱导NIH 3T3-Hyal2-HA细胞形成明显细胞集落，细胞集落形成率为57%；磷酸化Akt（pT308）含量只有pcDNA-TM诱导转化组显著升高，磷酸化Akt（pS473）含量pcDNA-TM、pcDNA-SU、SU和TM共转染3个组显著升高。SSCP分析初步显示：JSRV-Env、JSRV-TM、JSRV-SU对NIH 3T3细胞和NIH 3T3-Hyal2-HA细胞的nras、kras、pik3ca、egfr、p53外显子基因可能均未致突变。.检测OPA自然病例基因突变显示：nras(exonl,2)，kras (exon2), pik3ca(exon9), egfr(exonl7,20), p53(exon6)未发生突变，kras(exon1)和p53(exon7)检测到突变。其中：二例阳性样本kras基因第一外显子核苷酸突变位点为35G→T（第35位核苷酸由G突变为T），编码的氨基酸位于第12密码子：12G→V（第12位氨基酸由G即甘氨酸突变为V即缬氨酸）；一例阳性样品p53基因第7外显子检测出突变，核苷酸突变位点为：825T→C, 但编码的氨基酸未发生突变，依然是C即半胱氨酸。.在前人研究的基础上，我们首次报道：SU与 TM 组合能引致NIH3T3 细胞转化；TM能引致NIH 3T3-Hyal2-HA 细胞转化；TM以及SU与 TM 组合可作为靶细胞异常增殖的起始信号；在信号转导中Kras一级结构突变和磷酸化Akt（pT308，pS473）含量显著升高起重要作用。.本研究分别建立了稳定表达JSRV-TM的HepG2细胞系和稳定表达JSRV-SU 的A549 细胞系；报告了绵羊内源性JSRV的全序列（7 519bp），山羊内源性JSRV的全序列（7 480bp）；还建立了特异性PCR 及LAMP检测JSRV的方法，后者专利已获国家知识产权局批准（专利号ZL 2012 1 0274280.7）。