tau蛋白对线粒体分裂融合动态的影响及其在神经元生存死亡中的作用

线粒体是不断进行分裂、融合的动态细胞器，分裂是细胞凋亡的早期表现，而融合蛋白MFN2和OPA1可对抗凋亡。申请者前期研究发现，tau过度磷酸化可通过线粒体途径对抗淀粉样肽（Abeta）引起的凋亡，而过表达tau促进线粒体融合，提示tau可能通过改变线粒体分裂融合动态而调节细胞的生存命运。本项目拟构建野生型及不同位点假性过度磷酸化的tau病毒表达载体，在原代培养神经元、转人类tau基因（htau）和共转htau和突变淀粉样蛋白（APP）基因小鼠，研究tau异常表达和不同位点过度磷酸化对线粒体分裂融合动态的影响及其与细胞生存的关系，并从分裂蛋白与融合蛋白平衡以及线粒体功能等角度探讨tau引起线粒体动态变化的机制。该研究将揭示tau蛋白聚集或过度磷酸化如何影响线粒体分裂融合动态及其在神经元生存中的生理和病理作用，为阐释申请者发现并报道的"tau蛋白磷酸化调节细胞生存命运"的分子机制提供实验依据。

Tau蛋白既是组装微管和维持微管稳定性的重要骨架蛋白，也是AD脑内神经元纤维缠结的重要组分。最近研究发现AD患者或AD样动物大脑神经元有显著的线粒体形态分布异常和功能障碍。但是，AD脑内也存在全长tau蛋白，而tau蛋白是否影响线粒体动态，且其在细胞及神经退变中是否起作用未有研究报道。本项目探讨过表达人全长tau（htau40）对线粒体分裂、融合动态，线粒体功能及神经元突起退变的影响及其机制。.本研究发现：（1） tau稳定或瞬时过度表达引起大量HEK293细胞和大鼠原代海马神经元出现线粒体形态和分布障碍，表现为线粒体延长并聚集在细胞核周围，细胞突起部位分布的线粒体数目显著减少；(2) 稳定或过度表达tau蛋白引起HEK293细胞线粒体融合速度显著加快；（3）tau过度表达引起HEK293细胞及小鼠海马线粒体融合蛋白水平Mfn1、Mfn2和OPA1水平显著升高; (4) 下调融合蛋白Mfn1和Mfn2可部分逆转稳定表达htau的HEK293细胞的线粒体形态和分布障碍; (5) 荧光定量PCR发现Mfn2 mRNA水平升高；20s蛋白酶小体活性下降；抑制mRNA合成后， Mfn2水平高于对照组；（6）证明鼠tau蛋白可定位于线粒体内膜，htau蛋白定位于线粒体膜间隙或靠近内膜处；（7）发现tau蛋白过度表达升高线粒体基础膜电位，PINK1水平显著下降；（8）发现在HEK293细胞tau过度表达早期不影响Complex I活性及ATP水平，晚期使二者下降，htau转基因动物内Complex I活性降低；（9）tau稳定过度表达或瞬时表达48h引起HEK293细胞出现退行性变化，突起变短变细，或出现肿胀、断裂等变化；（10）tau过表达引起原代海马神经元的线粒体聚集在核周围或短树突内，突起内线粒体密度显著降低，突起数目显著减少，轴突长度显著缩短，突起出现串珠样断裂等退行性变化。（11）过表达htau早期引起线粒体融合加速、聚集在细胞核周围，晚期引起Comlex I 活性降低和ATP生成减少，使细胞出现退行性改变。htau升高线粒体基础膜电位，抑制PINK1转位于线粒体上，使融合蛋白Mfns泛素化降解障碍，从而导致线粒体动态改变的机制。（12）htau过表达导致线粒体自噬障碍。.本研究结果丰富了tau在AD发病机制中的重要作用，提示抑制tau蛋白聚集是一个新的治疗策略。