自噬通路在艰难梭菌毒素杀伤宿主细胞过程中的作用探究

艰难梭菌(Clostridium difficile)通过分泌两种毒素蛋白（TcdA/B）致病，是全球范围导致抗生素相关腹泻和假膜结肠炎的主因。作为严重威胁公共生命安全的感染性疾病，艰难梭菌通过毒素侵染的机制还不十分清楚，这严重阻碍了有效治疗手段的研发。虽然细胞自噬（autophagy）被越来越多地发现与病原微生物的侵染有关，目前尚无报道显示Tcd毒素侵染与自噬有任何关联。我们的实验显示，Tcd侵染显著提高了细胞的自噬水平，而对细胞自噬的改变又能直接影响宿主对毒素的感受性。本课题将致力于证明Tcd毒素是否和如何影响宿主的自噬，以及宿主的自噬机制是否和如何影响Tcd毒性。我们同时希望厘清Tcd是如何通过自噬通路导致宿主细胞的凋亡，特别是寻找潜在的与Tcd毒素相互作用的宿主细胞自噬通路蛋白。这项研究将深化人们对艰难梭菌引起的感染性腹泻的发病机理的认识，并对发展新型治疗手段提供新的药物作用靶点。

艰难梭菌(Clostridium difficile)通过分泌两种毒素蛋白（TcdA/B）致病，是全球范围导致抗生素相关腹泻和假膜结肠炎的主因。作为严重威胁公共生命安全的感染性疾病，艰难梭菌的感染机制还不十分清楚，阻碍了有效治疗手段的研发。虽然细胞自噬被越来越多地发现与感染有关，艰难梭菌毒素与自噬的可能关联目前尚无报道。我们首次证明TcdB通过其N端糖基化转移酶活性诱导细胞自噬，而这一过程和其糖基化转移酶抑制Rho家族小GTPase进而破坏细胞骨架的机制相互独立。TcdB通过不依赖mTOR的方式激活早期细胞自噬通路，然后通过后期对mTOR活性的抑制来维持高水平的自噬活性。自噬通路的激活在低浓度TcdB毒素条件下抑制细胞增殖，在高浓度下抑制细胞凋亡。ATG7对TcdB诱导细胞自噬通路必不可少，而TcdB能够加强VPS34和ATG14L以及VPS34和UVRAG之间的相互作用。该研究结果为细菌感染性疾病研究领域提供了新的感染模型，并为艰难梭菌的临床治疗提供了重要的理论依据。在这一研究中，还发现BECN1对LC3脂质化和自噬小体的形成与之前的报道不符。BECN1被认为是在第III类PI3K复合物的重要组成部分，在哺乳动物细胞诱导自噬反应中起重要作用。尽管在许多细胞和生理过程中作用显著，BECN1在细胞自噬中的确切功能仍存在争议。我们发现BECN1的完全缺失对LC3脂化和自噬体的总数影响不大，但是影响了自噬体的形态以及其降解细胞内大分子的功能。深入的研究证明BECN1对自噬小体的形成以及自噬溶酶体降解内吞物至关重要，以LC3的脂质化作为检测自噬通路指标具有极大的局限性。我们的结果将BECN1在LC3脂化以及自噬体形成和功能发挥区别开来，指出了LC3脂化作为自噬唯一生物标志的局限性。受该基金支持，我们还发现并证实了艰难梭菌毒素B（TcdB）的第一个受体蛋白CSPG4；建立了基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除文库及高通量功能性筛选技术平台；建立了高效的TALENs相关的基因组编辑技术平台；完成了多项包括与TcdB相关的功能性筛选工作。发表与基金支持相关的SCI论文8篇，其中包括一篇Nature、两篇Cell Research、一篇Autophagy等高影响因子论文。申请6项发明专利，已获得3项授权。