靶向人Ⅰ型羰基还原酶的类黄酮抑制剂筛选及作用机制研究

Resistance against anticancer drugs is a major problem in the clinical chemotherapy of malignant tumors. Human carbonyl reductase 1(CBR1) is the key drug metabolism enzyme that could inactivate anti-tumor drugs, such as anthracycline daunorubicin, doxorubicin and oracin. It has been speculated that searching and developing CRR1 inhibitors to prevent carbonyl reduction may be an effective approach for drug clinical application. ..Given the fact that the known CBR1 inhibitors contain flavonoid-like structures and the favonoid chemicals have potential pharmacological properties, we are planning to screen novel inhibitors of CBR1 from the library of flavonoid chemicals. We will measure the enzymatic kinetics and the binding constant of inhibitors by enzyme assay, isothermal titration calorimetry（ITC） and surface plasmon resonance(SPR). Further, we will select the hits with highest affinity to CBR1 and determine its complex structure with the enzyme. We aim to understand the structure-activity relationships (SAR) and molecular mechanism of inhibitors targeting to CBR1.We also plan to test the synergism effect of new CBR1 inhibitors with anthracycline drugs on anti-tumor activity. The co-administration could be a promising strategy for overcoming drug resistance in clinical application.

肿瘤细胞的耐药性是临床化疗面临的重要难题之一。Ⅰ型羰基还原酶(CBR1)是人体重要的药物代谢酶，可代谢柔红霉素、阿霉素等蒽环类药物以及oracin等抗癌药物，导致肿瘤细胞耐药性产生。因此以CBR1为靶点，寻找和开发使该酶失活的特异性抑制剂可逆转耐药性，具有重要的临床应用价值。本项目基于已有的CBR1抑制剂的类黄酮结构特征以及类黄酮化合物的良好药用价值，拟从类黄酮结构类似物库中进行CBR1新型抑制剂的筛选，希望找到亲和力更高、抑制效果更好的CBR1抑制剂。我们将综合酶活力测定、等温量热滴定和表面等离子共振等方法表征抑制剂的酶学动力学特征和结合常数，并选取活性好的抑制剂制备复合物晶体，获得三维结构信息，从而全面阐释抑制剂的构效关系以及作用的分子机理，为化合物结构的进一步改造设计提供线索。本项目还将在细胞学水平初步探索抑制剂和蒽环类药物的协同抗肿瘤效果，为先导化合物临床应用提供依据。

蒽环类抗癌药物，如柔红霉素和阿霉素，是最有效的抗癌药物之一，可广泛治疗多种癌症，包括白血病和实体瘤。但是由于肿瘤细胞对此类药物耐药性和对健康组织的毒性，特别是心脏毒性，使它们在临床上的应用受到一定限制。人Ⅰ型羰基还原酶（CBR1）是人体一类重要的药物代谢酶，在多种组织中广泛存在，可以代谢多种药物，可将蒽环类药物柔红霉素和阿霉素代谢为抗癌效果大大减弱但具心脏毒性的醇代谢物。针对以上情况，以CBR1为靶，寻找它的高效抑制剂，在临床上与蒽环类药物联合使用，具有逆转药物耐受性，降低毒副作用的功效。.已知的一些CBR1抑制剂为具有类黄酮结构的化合物，类黄酮化合物也具有重要的临床应用价值。我们建立了CBR1的体外酶活测试系统，对含有类黄酮结构的化合物进行了筛选，寻找到化合物F21可有高效抑制人的1型羰基还原酶（CBR1）的活性,F21是茶多酚EGCG的结构类似物，在茶叶泡制的过程中会转化产生。我们检测了F21对CBR1活性抑制的动力学特征，测定了F21对CBR1的还原活性的抑制的IC50为0.38μM，优于已知的CBR1黄酮类抑制剂。 测试了F21对CBR1的抑制类型，检测了F21对辅酶NADPH和底物吲哚满二酮的抑制类型均为非竞争型，提示F21结合位置既不同于辅酶也不通于底物的结合位置。F21抑制CBR1活性具有pH依赖性.中性和弱碱性的条件抑制活性高，这一pH正好涵盖人体体液的pH ,弱酸性条件下较弱。可能是F21在不同pH条件下，包括质子化和去质子化的状态，从而表现出对蛋白不同的亲和力。通过比较结构类似物的抑制活性差异，提示F21结构中的没食子酸酯基为抑制CBR1的关键部位。采用了分子模拟和分子动力学的方法，获得了F21和CBR1结合的三维结构数据。三维结构中，F21结合在CBR1活性中心，AC环和Try229形成π-π共轭的作用，D环和Trp193及Val95形成疏水作用.D环的酚羟基和Phe99的主链羰基形成氢键作用。将这些关键残基突变后，F21对CBR1的抑制活性显著减弱，进一步验证了结合模型的可靠性。综上所述，我们结合生化实验的结果和三维结构的信息，分析探讨了筛查到的新型抑制剂和CBR1的抑制机制和结合模式，也为下一步药物先导化合物的结构的改造和临床药物使用提供了重要线索和依据。