纳米自组装短肽在病毒三维细胞培养模型中的应用研究

With special amino acid sequences and easy to be modified functionally, self-assembling peptides can self assemble into nanofiber structures, which can simulate the porosity and the structure of the extracellular matrix of the body, and can be used as suitable three-dimensional culture support for cells in vitro. Because of the strict intracellular parasitism of viruses, cell culture techniques are commonly used in the study of viruses in vitro. In this project, the technique of three-dimensional cell culture with self-assembling peptides and the technique of the combination of the three-dimensional cell culture with virological technologieswere established. By electron microscopy, immunefluorescence, ELISA, RT-PCR and virological technologies, cell morphology, vitality, and histology of host cells and virus proliferation, protein expression(HBsAg, HBeAg, PreS1Ag and Pres2Ag) and influence of viruses on host cells in the culture system were analyzed. studies on biological characteristics of cells and viruses in self-assembling nanopeptide three-dimensional culture system on cellular and molecular levels and further exploration of the relationship between viruses and host cells or stent materialsand host cellswill provide experimental foundation and theoretical basis for three-dimensional culture model of the cells with virus to. The research will also provide a new method for the study of the pathogenesis of viral disease, the screening of antiviral drugs and the preparation of antiviral vaccines.

纳米自组装短肽具有独特的氨基酸序列特征，可进行功能化修饰，并能自组装形成纳米纤维结构。该结构能模拟体内细胞外基质的孔隙度和结构，适合作为体外细胞三维培养支架。病毒具有严格的细胞内寄生性。细胞培养技术常用于病毒的体外研究。本项目将纳米自组装短肽三维细胞培养技术与病毒学试验技术相结合，通过建立纳米自组装短肽三维病毒细胞培养模型，利用电子显微镜、免疫荧光、ELISA、RT-PCR等实验技术，对病毒宿主细胞形态学、活力、组织学分析及病毒增殖情况、蛋白表达、病毒对宿主细胞的影响进行分析，从细胞和分子水平上研究在纳米自组装短肽三维细胞培养支架上细胞及病毒的生物学特征，进一步探讨病毒—宿主—支架材料之间相互关系，为建立病毒细胞三维培养模型提供实验基础及理论依据，也为今后病毒发病机制的研究、抗病毒药物的筛选及疫苗的制备提供一种新型的实验研究手段。

纳米自组装短肽拥有独特的氨基酸序列特征，具有两亲性，在生理条件下通过分子自组装后形成纳米纤维支架（即纳米水凝胶，Nanogel）。这种纤维支架具有5-200nm大小的孔隙，较好地模拟了体内细胞外基质的孔隙度和结构，适合作为体外细胞三维培养支架。本项目将纳米自组装短肽三维细胞培养技术与病毒学试验技术相结合，构建自组装短肽病毒Nanogel三维细胞培养模型，为体外开展病毒相关研究提供一种新的实验技术打下基础。研究发现：纳米自组装短肽在盐溶液下自组装后可形成具有一定孔隙的纤维网格结构，该结构有利于细胞的粘附，与Ⅰ型胶原、Matrigel相似；在Nanogel三维培养体系中细胞生长情况良好；293T细胞在Nanogel三维培养体系中培养24h后，腺病毒可通过Nanogel孔隙感染293T细胞，并在细胞内持续增殖时间较长，其病毒复制子仍具有感染性，与在Ⅰ型胶原中增殖相似，其药物敏感试验结果与二维细胞培养不同；乙肝病毒基因转染细胞在Nanogel三维培养条件下相关蛋白表达稳定，优于人血清乙肝病毒感染细胞模型，结果与在Ⅰ型胶原中的培养相似；MDCK和A549细胞在Nanogel三维培养体系中培养24h后，流感病毒（PR8/H1N1）通过Nanogel孔隙均能使其感染，但在动物来源的MDCK细胞中感染持续时间明显长于来源于人肺组织中的A549细胞，具体原因需进一步探讨。该研究初步探索了纳米自组装短肽在病毒感染细胞模型中的应用，研究表明纳米自组装短肽有助于在体外开展病毒与宿主细胞之间的相互作用及抗病毒药敏筛选试验的研究，研究成果为这类人工设计合成的自组装短肽纳米材料在病毒学研究中的应用提供了一定的理论依据和实验基础，也为病毒体外培养及研究提供了一种新思路。