用于神经动作电位记录的高速双光子显微成像方法研究

Voltage sensitivity dyes can more accurately reflect nerve action potentials than calcium sensitive probes. Combining voltage sensitivity dyes with two-photon microscopy to have in vivo imaging would be helpful for the function research of neural networks. However, acousto-optic scanning two-photon microscopy with sub-millisecond resolution has the problem of serious femtosecond laser distortion. This project will develop a high-speed low distortion femtosecond laser scanning method which will increase the speed of two-photon microscopy to 10000 frames per second with 250×40 picture size, and then develop a real-time online method to reconstruct action potentials from high throughput two-photon image data. Ultimately, a method to record nerve action potentials with high-speed two-photon microscopy will be developed through this study.

相比钙敏感荧光探针，电压敏感染料能更准确地捕捉亚毫秒变化的神经动作电位信号，结合组织穿透深度高的双光子显微镜，将十分有利于研究活体动物神经网络的功能活动。但目前基于高速声光扫描的亚毫秒时间分辨率双光子显微成像方法存在飞秒激光畸变严重的问题。有鉴于此，本项目拟发展一种高速低畸变的飞秒激光扫描方法，使双光子显微镜的成像速度达到10000帧每秒（250×40图像像素），并在此基础上发展一种神经动作电位信号实时在线重建方法，为在高通量双光子图像数据中准确在线重建神经网络放电活动情况提供途径，最终形成一种能用于神经动作电位记录的高速双光子显微成像方法。

神经元网络的结构和功能研究是当前的一个热点。神经元的放电活动很快，传播速度在毫秒量级。高速双光子显微镜能更准确地捕捉亚毫秒变化的神经动作电位信号，有利于研究活体动物神经网络的功能活动。但目前基于高速声光扫描的双光子显微成像方法存在飞秒激光畸变严重的问题。本项目针对上述问题，发展了一种高速低畸变的飞秒激光扫描方法。通过传递函数分析方法，综合研究了高速声光扫描过程中柱面镜效应、激光非准直度引起的衍射畸变效应、时空色散效应三者对飞秒激光光学特性的影响规律，确定最优的光学补偿参数；通过有限元方法对声光偏转器进行了热力学仿真，提出采用阵列换能器电极结构优化声光偏转器的散热设计。搭建了基于高速声光扫描的双光子成像系统，发展了神经动作电位信号在线重建方法。经测试，该系统的成像速度达到9885.6Hz@250*40pixels，同时横向光学分辨率达到0.62µm，纵向分辨率达到2.59µm，证明了项目提出的高速低畸变飞秒激光扫描方法是可行的。该系统目前已取得初步的生物学应用，记录了在体小鼠脑皮层精细突起结构的图像，准确重建了动作电位钙信号。此外，本项目还发展了多视野阵列复合物镜结构和多脑区双光子显微成像方法，将双光子显微镜的成像视野直径范围扩展到了10mm。本项目发展的新型双光子显微成像方法为神经科学研究提供了有力的研究工具。