miR-203调控表皮损伤修复的机制研究

miR-203优势表达于增殖/分化的表皮细胞中，参与皮肤发育和疾病病理。我们前期发现皮肤损伤修复伴有miR-203显著升高，提出miR-203参与皮肤损伤修复调控的假说。本项目拟分析在体小鼠皮肤和离体钙诱导表皮角朊细胞分化模型上，用芯片分析、原位杂交、蛋白印迹、RT-PCR、ChIP等方法，系统地研究硫芥皮肤损伤修复中，miR-203表观遗传学调控、miR-203表达的时空特点，miR-203表达与损伤修复相关病理、相关基因表达、信号通路之间的关系；在体和离体模型上，以稳定过表达载体和GOF/LOF策略干预miR-203的表达，观察其对表皮角朊细胞增殖、分化、迁移、凋亡，以及损伤修复相关基因表达的影响；结合基因表达谱芯片和报告基因-候选UTR技术筛选miR-203的靶基因，阐明miR-203对于表皮损伤愈合的影响及其机制，以完善表皮损伤修复的调控理论，为临床干预皮损修复提供新策略和治疗靶点

MiRNA-203特异性表达在上皮组织的表皮中，主要在角质形成细胞中表达，且伴随分化开始表达，促进分化。我们提出miR-203参与皮肤损伤修复调控的假说。主要研究结果如下：1.离体角质形成细胞模型（NHEK和HaCaT）芥子气（硫芥或氮芥）染毒后，miR-21的表达受到抑制，上调miR-203和miR-198的表达；miR-203的靶基因p63的表达受抑，与线粒体呼吸链功能密切相关的ISCU和COX-10蛋白都在硫芥染毒后表达升高。。miR-203抑制物（atg-miR-203）抑制细胞存活；模拟物ago-miR-203未显示保护作用。染毒有促进分化作用，抑制细胞增殖和迁移，细胞自噬加强。2.确定了无毛小鼠皮肤硫芥染毒的适宜染毒剂量和方式。与创伤不同，芥子气引起的难愈性创伤病理过程明显延迟。7d时，创周炎性反应明显并形成真皮层的“U”形细胞反应聚集带。创缘细胞迁移滞后于普通创伤约一周。3.染毒后1-14天的皮肤组织进行miRNA表达谱检测和炎性蛋白为主的蛋白检测，发现了一些可能作为损伤过程的标志性分子，如CRP、endostatin、miR-466家族等。4.皮肤miR-203在硫芥损伤后1-14d时，miR-203呈现升高。原位杂交发现伤后1d在创周表皮 miR-203表达升高；3-7d时升高更明显 且皮肤附件也高表达；14d时表达有所回落，增殖旺盛的表皮有阳性信号。5.在愈合后期（切割伤10-14d，硫芥染毒21-28d），atg-miR-203显著地抑制皮肤修复进程，而ago-miR-203促进损伤的修复（切割伤10d前，硫芥染毒21d前），但在晚期（切割伤10d后，硫芥染毒21d后）未显示出明显的差异。6.miR-203基因启动子CpG岛处于低甲基化水平，染毒后96h甲基化水平无明显改变；基因组整体甲基化水平变化也不明显，如0.5mM硫芥染毒6h后甲基化水平由1.28%升高到1.37%。7.明确了正常和芥子气染毒时Fra-1在表皮的表达变化。在体和离体均证实染毒后Fra-1显著降低。EGF处理后显著增加，Ca2+诱导分化后降低。转染miR-203的模拟物使miR-21的表达水平下调，与Junb表达负相关，与PTEN正相关。8.NHEK染毒后miR-203靶基因p63和SOCS-3的表达降低，miR-21靶基因PDCD4和PTEN的表达升高。细胞高表达miR-203时，JunB表达升高，同时PTEN表达升高。9.证实LPS刺激NHEK细胞Fra-1和COX-2（环氧酶）表达,Fra-1以促炎作用为主；在CEES染毒NHEK中，Fra-1抑制COX-2，以抑炎作用为主。Fra-1的磷酸化水平与细胞的p38磷酸化负相关，与ERK1/2磷酸化正向关。CEES 染毒激活p38和ERK1/2，促进c-Fos/AP-1的生成。10.Fra-1正向调控uPA的表达，EGF能促进Fra-1表达，导致uPA对组织蛋白溶解加强。11.首次提出AP-1作为中介分子协同调控miR-203和miR-21表达，也就是c-Fos与不同的c-jun成员结合形成的异二聚体，对miR-203和miR-21表达有不同的转录调控能力。12.首次发现miR-198通过靶向CCND2显著抑制细胞增殖和迁移，确定了主要结合序列。