RGDS共价修饰的纳米金刚石：递送siRNA的新型肿瘤靶向载体研究

siRNA is clinically used for gene therapy in several pathological conditions including cancer, autoimmune, infection and neuronal disease. Due to negative-charge, water-solubility and high molecular weight a naked siRNA is unable to cross the cell membrane. In this study we prepared siRNA/NDCO-RGDS to transfer siRNA. We aimed to demonstrate that the carrier could efficiently deliver siRNA into cancer cells, induce significant gene silencing effects, and lead to regulate the related protein expression in cellular levels. The morphological structural features and gene transfection efficiency in vitro will be characterized. The gene silencing efficiency was investigated by RT-PCR, and the protein expression was detected by ELISA and Western blotting. The Migratory capacity was evaluated by HUVEC, and the cytotoxicity of the carrier was measured to prove the low cytotoxicity. To study the effect of genes in new vessels of implanted breast cancer，nude mice was used to be the model in vivo. The purpose of this study was to demonstrate the feasibility of NDCO-RGDS to be a promising delivery system for therapeutic applications.

siRNA为肿瘤治疗带来了希望。可是半衰期短、特异性分布差、易被血管壁和组织屏障及难被细胞摄取等问题限制了siRNA的临床应用，寻找适宜的siRNA载体成为研究热点。申请人曾用纳米金刚石将siRNA送入肿瘤细胞，并使基因沉默。为提高肿瘤靶向性，本项目将肿瘤可识别的RGDS与纳米金刚石（ND）共价结合，制备新型载体“NDCO-RGDS”，然后加载包括VEGF-siRNA在内的肿瘤新血管生成siRNA，构成全新的运载体系“siRNA/NDCO-RGDS”。利用电镜、红外、DSC表征其加载siRNA特性，检测这些粒子在促进siRNA细胞摄取过程中的分子机制，包括细胞膜结合、细胞内吞、胞浆释放动力学、转染效率及基因沉默效应。用荷瘤鼠评价肿瘤靶向性及抑制肿瘤新血管生成作用。完成本项目，预期可构建一个全新的siRNA运载系统，为siRNA肿瘤治疗奠定基础。

siRNA 作为新型基因治疗药物为攻克癌症带来了希望，于是 siRNA 传输系统研究快速升温。然而，siRNA 传输系统的研究面对四个问题：（1）siRNA半衰期短，（2）特异性分布差，（3）易被靶细胞前的血管壁和组织屏障，以及（4）难被细胞摄取。因此，siRNA治疗的实用化寄希望于不断改进siRNA运载系统。.纳米金刚石（Nanodiamonds, ND）因其细胞转移能力和抗酶切的显著优点，作为DNA和RNA等核酸类药物的载体研究开始受到关注。本课题组前期已发表的研究论文表明，物理吸附RGDS的ND具有一定的肿瘤靶向性，并可使细胞中的VEGF mRNA和蛋白表达降低。为了进一步的减少物理吸附载体在传输过程中的渗漏问题，本课题将RGDS与ND通过形成酰胺键共价键合，这样既保留了肿瘤识别的主动靶向性，又克服了传输中RGDS泄漏的弊端。本课题将RGDS与ND通过酰胺键共价键合，制备得到一种全新的具有靶向性的“NDCO-RGDS”传输系统来递送siRNA，提高siRNA的转染效率。本课题制备得到递送载体NDCO-RGDS/siRNA的粒径为44.1-127.3 nm，Zeta电势为35.65±3.85 mv。凝胶阻滞实验表明NDCO-RGDS与siRNA的N/P比为25:1。激光共聚焦显微镜显示转染后siRNA主要分布在细胞核周围。MTT实验结果显示NDCO-RGDS/siRNA体外抗肿瘤活性较好，呈现浓度依赖性，IC50为110.6 nM。NDCO-RGDS/siRNA可下调mRNA表达88.41 %±3.49%，可下调蛋白表达83.94%±2.00%。通过荷腹水瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤活性评价，在给药剂量为0.3 mg/kg下，抑瘤率为54.65 %（P > 0.05）。细胞毒性实验显示，与对照组相比无显著性毒性。.作为一种具有抗酶切和细胞转移能力高的载体，ND运载 siRNA能够保护其免受体内酶的降解，在循环系统中延长循环时间，具有较高的细胞转移能力，携带 siRNA 进入细胞，而不参与基因、蛋白的表达与调控。本课题制备得到一个全新的具有靶向性的“NDCO-RGDS”传输系统以递送 siRNA，提高 siRNA 递送的肿瘤靶向性和转染效率，并促进细胞内吞和实现基因沉默，为 siRNA 的肿瘤治疗奠定基础。