基于类辅酶配体的黄素酶构效优化机制研究

In this research, two typical flavoenzymes (a monomer of cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. with molecular mass at ~50 kDa; and a dimer of xanthine oxidase from Arthrobacter sp. with molecular mass at ~280 kDa) are to be studied. With the strategies of modification and simulation, coenzyme-like ligands for flavoenzymes are designed based on the key structure (isoalloxazine) of flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucletide (FAD). Through a multiple screening method, the recognition abilities and functional effects of these ligands for flavoenzymes are efficiently investigated. The principles of dynamic and static interactions of enzyme-ligand complexes are studied with thermodynamics methods. The active groups on the enzyme surfaces are estimated and calculated with molecular simulation and experiments. Consequently, with the enzyme free and immobilized stategies, these groups are to be linked with modification molecules. In addition, modification chemicals could be linked with ligands as vehicles to directly participate the conformation and maintenance of enzyme-ligand complex; then their influences on enzyme structures, enzyme-ligand interactions and natural biofunctions would be studied. This research is to reveal the principles of structural and functional effects of coenzyme-like ligands on flavoenzymes, and to provide theoretical basis for the rational optimization of flavoenzymes.

本研究以两种典型黄素酶为对象（其中，红球菌源胆固醇氧化酶为单亚基单体形式，分子量为约50 kDa；节杆菌源黄嘌呤氧化酶为双亚基二聚体形式，分子量为约280 kDa），基于黄素辅酶（黄素单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD））核心部件异咯嗪环的基本结构，通过修饰及模仿的策略，设计并合成类辅酶配体。通过多通道的筛选方法，快速监测各配体与酶的适配能力以及对生物功能的影响。利用热力学方法研究酶-类辅酶配体在动态、静态环境下的相互作用机理。同时，利用分子模拟以及实验方法估算酶表面的活性基团，采用游离型及固定型的策略将其与活性修饰剂连接。此外，将修饰剂作为载体与配体相连接，直接参与酶-配体复合体的形成与维持；考察修饰方式对酶的整体结构、酶-配体相互作用及生物功能的影响。本研究拟深入揭示类辅酶配体对酶结构功能的影响机制，为黄素酶的理性构效优化提供理论依据。

本项目选取典型的黄素酶为研究对象，包括红球菌源胆固醇氧化酶（单亚基单体，分子量约50 kDa），芽孢杆菌源肌氨酸氧化酶（单亚基单体，分子量约45 kDa），以及节杆菌源黄嘌呤氧化酶（双亚基二聚体，分子量约280 kDa）。基于黄素辅酶（黄素单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD））核心部件异咯嗪环的基本结构，通过修饰及模仿的策略，设计类辅酶配体。研究类辅酶配体与酶的识别及相互作用机理，并进一步阐述类辅酶配体对黄素酶的特异性识别、结构以及生物学功能的影响。同时，利用修饰剂对酶分子表面的活性基团进行连接，直接参与酶-类辅酶配体复合体的形成与维持。.在对红球菌源胆固醇氧化酶的研究中，以FAD的结构为基准，系统地设计并合成人工亲和配体库，利用分子生物学软件模拟，并结合实际的实验验证，深入解析酶-辅酶的吸附-解离模型。基于优化类辅酶配体RL-1与RL-2，建立了高效的胆固醇氧化酶亲和纯化方法，胆固醇氧化酶的理论最大吸附值分别达到~83.5和46.3 mg/g,解离常数分别达到~6.02×10−10and 1.19×10−10 mol/L,回收率高于90 %，纯度高于95 %。此外，利用RL-1及RL-2取代天然辅酶FAD后，胆固醇氧化酶的活性分别提高至原始活性的145.3 %及202.4 %。.在对芽孢杆菌源肌氨酸氧化酶的研究中，利用底物类似物作为亲和配体，建立了高效的亲和制备工艺，肌氨酸氧化酶的理论最大吸附值达到~52.7 mg/g,解离常数达到~7.61×10−7 mol/L,回收率达到90.8 %，纯度达到99 %。此外，构建了聚赖氨酸修饰技术，将肌氨酸氧化酶对pH值的耐受性由天然酶的7-9扩展至5-10，将37℃水相中肌氨酸氧化酶的活性半衰期由天然酶的3天提升至近3个月。模拟并设计了一组类辅酶配体，取代天然辅酶FAD，通过与酶新形成新的相互作用，能够有效的提升酶在有机溶剂中的稳定性以及活性保留量。.在对节杆菌源黄嘌呤氧化酶的研究中，通过对辅酶结合域，类辅酶配体以及两个亚基之间的相互作用的研究，初步解析了黄嘌呤氧化酶的热稳定性机制。