LDLR调控EGFR影响肾细胞癌恶性潜能的实验研究

Recent studies have focused on the relationship between metabolic syndrome and renal cell carcinoma (RCC), and its underlying mechanisms. However, little is known about the role of dyslipidemia that is an important component of metabolic syndrome in RCC carcinogenesis. Our previous researches have observed the association of low-density lipoprotein (LDL) with RCC risk and progression. Further studies found that down-regulation of LDL receptor (LDLR) in human RCC cell lines ACHN could remarkably inhibit cell proliferation, migration and invasion. In addition, we observed an interaction of LDLR with EGFR, EEA1 and RAB1A, respectively. Based on these results, we hypothesize that LDLR might play a role in RCC carcinogenesis through the interaction with EGFR, where endocytosis might be involved. Consequently, we aim to obtain the detailed understanding of the role of LDLR in RCC, as well as the mechanisms underlying the interaction between LDLR and EGFR, by means of LDLR mutant construction, co-immunoprecipitation, lentivirus infection, nude mouse tumorigenicity assay, dynamic co-localization and biotinylation internalization and recycling assay, et al. Finally, we would like to reveal the detailed role of LDLR in RCC carcinogenesis from a new perspective of how LDLR interacts with EGFR, and provide evidence of potential therapeutic targets.

代谢综合征和肾细胞癌的相关性及机制研究是近年来的研究热点，而对其重要组成因素-血脂异常在肾癌发生发展中的作用目前研究较少。我们前期研究观察到低密度脂蛋白水平升高与肾癌发病风险及进展密切相关，在人肾癌细胞系ACHN中下调低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，且LDLR和EGFR、EEA1、RAB1A存在相互作用，推断LDLR可能通过调控EGFR参与肾癌发生发展，且该环节涉及细胞内吞再循环过程的变化。基于此假说，我们拟通过构建LDLR突变体、免疫共沉淀、慢病毒载体转染、裸鼠成瘤实验、动态免疫共定位、生物素化内吞及再循环实验等手段，从分子、细胞及动物水平等多方面探讨LDLR在肾癌中的重要作用，明确LDLR调控EGFR的机制。本研究将从LDLR通过调控EGFR影响肾癌生物学行为这个新的视角出发，为揭示血脂异常在肾癌中的作用提供依据，为临床探索可行治疗靶点提供新思路。

1、项目背景：代谢综合征和肾细胞癌的相关性及机制研究是近年来的研究热点，基于前期实验结果，我们推断低密度脂蛋白受体（LDLR）可能与肾癌的发病有关，并可能通过调控EGFR参与肾癌发生发展。基于此假说，我们探讨LDLR在肾癌中的重要作用，明确LDLR调控肾癌糖代谢的机制。.2、主要研究内容：1）构建了LDLR knockdown的肾癌细胞稳转株；2）检测了LDLR knockdown后肾癌细胞中HIF-1α的表达情况；3）利用能量代谢分析系统分析LDLR knockdown后肾癌细胞外的酸化程度（ECAR）以及线粒体的氧化呼吸耗氧率（OCR）来反映肿瘤细胞的糖酵解能力的变化；4）检测了LDLR knockdown后肾癌细胞中糖酵解关键基因的表达；5）检测了LDLR对HIF-1α转录活性的影响，并通过CHX抑制蛋白合成的办法来检测HIF-1α的半衰期；6）鉴定了LDLR和EGFR的相互作用；7）探讨了LDLR多态性与肾癌风险的相关性；8）研究了LDLR-rs2738464多态性对LDLR mRNA和蛋白表达的影响；9）研究了LDLR-rs2738464多态性对microRNA结合LDLR- 3’-UTR能力的影响。.3、重要结果：（1）在LDLR knockdown的肾癌细胞中，HIF-1α的表达均降低, 并且HIF-1α的半衰期明显变短；（2）在LDLR knockdown后，肾癌细胞的ECAR明显下调，同时细胞的线粒体氧化呼吸能力得到增强；两种肾癌细胞中糖酵解过程的关键基因GLUT1，HK2，PDK1 和LDHA表达明显下调；（3）LDLR可以以一种剂量依赖的方式，影响HRE-luciferase的活性，提示LDLR可以正向调节HIF-1α的转录活性；（4）LDLR-rs2738464 GG基因型与肾癌风险呈负相关；（5）LDLR-rs2738464多态性可影响肾组织中LDLR mRNA表达，且影响microRNA-330与LDLR-3’-UTR的结合。.4、科学意义：本项目通过分子生物学、代谢检测、多态性研究等手段，在分子和细胞水平及分子流行病学方面研究LDLR与肾癌风险的相关性及其可能机制，并进一步从细胞代谢角度探讨了LDLR对肾癌发生发展过程的影响，揭示了血脂异常在肾癌发病过程中的作用，为深入探索肾癌发病机制、寻求临床可行治疗靶点提供新的依据。