基于噬菌体展示技术肿瘤特异性多肽靶向机制研究及主动寻靶肿瘤热疗磁流体系统构建

The purpose of this research is to construct an active targeting magnetic fluid system for tumor hyperthermia or magnetic resonance imaging based on the phage-display peptide library, biomimetic mineralization technology and surface modification technology. First of all, the specificities of the peptides screened by phage-display library and the effects of temperature on the specificities of the peptides are investigated. The validity of screening multi-functional peptides with multi-targets including tumor cells and magnetic nanoparticles is verified. Then, the fuzzy mathematics and grey theory are applied to systematically analyze the effects of different peptide sequences and different peptide load ways on the binding specificity of the peptide and magnetic properties of the composite magnetic nanoparticles, in order to appraise the peptide sequence and optimize the comprehensive performance of the composite nanoparticles, so that to construct an active targeting magnetic fluid system composed of the tumor-specific peptides and the ferroferric oxide magnetic nanoparticles. Moreover, the influences of plasma proteins adsorption on the targeting properties of the magnetic nanoparticles are analyzed based on in vitro experiments. And the animal tumor models are used to model the in vivo circulation of the magnetic nanoparticles and to explore the active targeting assemble mechanisms. Finally, the preparation strategy and the evaluation standard of active targeting tumor hyperthermia system are developed, which could be served as the theoretical basis and experimental evidence for safe and effective clinical application of magnetic hyperthermia.

本研究基于噬菌体展示肽库技术、仿生矿化技术和表面修饰技术构建具有主动寻靶功能的肿瘤热疗磁流体系统，亦可用于核磁共振成像造影剂。研究噬菌体展示肽库技术所淘选多肽的特异性及温度变化对其特异性影响的规律，探索多靶标淘选肿瘤细胞和磁性纳米粒双结合特异性多肽的有效性。采用模糊数学灰色系统关联度法就不同多肽序列、不同负载方式对复合磁性纳米粒的结合特异性及磁性能影响的显著性进行综合分析，优化多肽序列及复合纳米粒的综合性能，构建具有主动寻靶功能的肿瘤热疗四氧化三铁磁流体系统。通过体外实验和动物肿瘤模型，系统分析血浆蛋白吸附对复合磁性纳米粒靶向性的影响，建立磁性纳米粒体内循环模型并探讨其主动靶向聚集机理，对所构建肿瘤热疗磁流体系统的生物学性能、靶向功能、磁热效应和抑癌作用进行综合考评，形成主动寻靶功能的肿瘤热疗磁流体系统的制备技术和考评体系，为临床安全有效的磁热疗应用提供理论基础和实验依据。

肿瘤靶向纳米磁流体系统在实现肿瘤磁热疗及MRI成像增强中具有极其重要的作用。本研究基于噬菌体肽库技术、仿生矿化技术和表面修饰技术构建具有主动寻靶功能的肿瘤磁热疗/MRI成像增强四氧化三铁磁流体系统。应用噬菌体展示随机七肽库Ph.D-7TM分别对卵巢癌A2780细胞和四氧化三铁磁性纳米粒进行淘选，得到具有A2780特异性靶向的多肽配体QQTNWSL肽和HGGVRLY肽以及对四氧化三铁磁性纳米粒高度亲和的TVNFKLY肽和HYIDFRW肽；将A2780靶向肽与磁性纳米粒亲和肽按照不同的碳端-氮端方式结合获得若干不同序列的十四肽，研究表明，LSWNTQQ-YLKFNVT为既与四氧化三铁磁性纳米粒高度亲和又对A2780细胞特异性结合的双功能肽。以卵巢癌SKOV-3细胞靶向配体WSGPGVWGASVK (WSG肽)作为模版，仿生矿化获得由均匀球形颗粒组装的短链铁磁性纳米四氧化三铁(饱和磁化强度Ms为52.22 emu/g，矫顽力Hc为91.97 Oe)，在赋予其肿瘤细胞靶向性的同时，可显著降低对正常细胞的毒性。以经WSG肽修饰的三嵌段聚合物PF127为模版，仿生矿化制备了结晶良好的尖晶石型四氧化三铁(粒径30-40nm，Ms为62.25emu/g，Hc为67.11Oe)，能在肿瘤组织特异性聚集，作为MRI造影剂其T2弛豫率为115.60 mM-1s-1，随聚集浓度的增加可显著提高成像对比度。采用共沉淀法制备葡聚糖(Dextran)包覆四氧化三铁，经WSG肽修饰后得到链长小于100nm的链状超顺磁四氧化三铁(Ms为46.5 emu/g；Hc小于50 Oe，T2弛豫率为114.85 mM-1s-1)，体内外试验表明其对SKOV-3细胞有特异性靶向，在正常组织和器官中无明显聚集。本项目在采用噬菌体肽库技术对卵巢癌A2780细胞和四氧化三铁磁性纳米粒进行淘选的基础上，通过多肽序列设计成功合成了具有肿瘤细胞靶向性和纳米四氧化三铁亲和性的双功能肽，可作为肿瘤磁热疗磁性介质或MRI造影剂的表面修饰剂赋予其肿瘤靶向功能；采用不同的仿生矿化及靶向修饰方法，成功合成了具有肿瘤主动靶向功能的纳米磁流体系统，并对其靶向机理及在肿瘤诊疗中的作用效应进行了较为系统的探讨，为开发癌症诊断与治疗的新方法奠定了理论与实验基础。