新型自组装纳米协同靶向抗耐药菌作用的研究

This study will first prepare the fusion protein of Ts-linker-MT in E. coli cells with DAN recombination and bioengineering techniques. Ts is an antimicrobial peptide and MT is a short protein fragment derived from the C-terminal of human cartilage matrix protein. In the recombinant of Ts-linker-MT fusion, MT is fused after the C-terminal of Ts with a flexible GGGS linker. Tigecycline is a positively charged antibiotic and could reach synergism against bacteria when in combination with Ts. A self-assembling of Ts-linker-MT into nanoparticles would be triggered in the presence of Tigecycline. The prepared nanoparticles are characterized of bifunctional antimicrobial patterns, pH-sensitive drug release and bacterial specific targeting. The composition, particle size and zeta potential will be studied by TEM, SEM and DLS. The bacterial specific targeting potential and drug release under different pH have to be researched as well. The in vitro antimicrobial potential could be evaluated with MICs and MBCs against standard strains and clinic isolates. The in vivo antimicrobial potential could be evaluated with a septic mouse model caused by different bacteria including drug-susceptible and -resistant bacteria. The in vivo dosage-effect relationship and differences between drug-susceptible and -resistant bacteria or between Gram+ and Gram- bacteria will be studied. In conclusion, we will explore the feasibility to kill the drug-susceptible and -resistant bacteria synchronously with a novel self-assembly nanomedicine of bacterial specific targeting potential. This study will provide a basis for clinic bacterial targeting therapy.

本项目拟用基因重组及生物工程法在大肠杆菌中制备以GGGS柔性片段为联接的抗菌肽“赛那汀”（Ts）与人软骨基质蛋白C末端（MT肽）的融合肽（Ts-linker-MT）；用与“赛那汀”具有协同作用的阳离子抗生素替加环素（Tc）激发，使融合肽自组装成纳米颗粒，制备具有双重杀菌机制、pH敏感释放的靶向抗耐药菌纳米；并在肽与抗生素的浓度及比例、DLS纳米粒径分散性和Zeta电位、电镜形态（SEM、TEM）、靶向结合、pH敏感释放等方面进行表征；对革兰氏阳性和阴性标准菌株和临床分离多重耐药菌进行体外杀菌试验；建立耐药和非耐药腹腔感染小鼠败血症模型，用靶向载药纳米进行干预治疗，获得剂量-时间-效应变化的多点数据，比较耐药与非耐药菌之间、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的治疗效果及差异，探索该系统作为一种新型纳米制剂实现对耐药和非耐药细菌同步杀灭的可行性，为靶向抗菌药物的临床前研究打下基础。

随着临床耐药的进一步恶化，预计到2050年，感染性疾病的死亡率将占到临床死因半数以上。临床急需开发一种针对当前耐药菌的新型治疗药物或者方案。本研究通过合理设计将抗菌肽和传统药物制备成靶向自组装纳米颗粒，并在体内外研究了了其抗菌活性。首先，我们通过设计和构建质粒在大肠杆菌中表达了抗菌肽融合肽Ts-MT并进行后续纯化；然后通过将Ts-MT肽和抗生素哌拉西林以不同比例混合使两者自组装成纳米颗粒并对所制备的纳米颗粒进行了表征；通过体外抗菌实验研究了所制备的纳米颗粒的体外抗菌活性，并研究了其细菌靶向性以及内毒素结合能力；通过构建败血症模型研究了所制备的靶向抗菌纳米在体治疗效果；通过细胞毒性实验和溶血实验研究了抗菌纳米的体外细胞毒性；最后，我们在小鼠体内研究了不同剂量的纳米颗粒的急毒性。结果显示，我们成功表达Ts-MT的融合蛋白，经Ni柱纯化和酶切后，通过HPLC进一步纯化去除内毒素获得了纯度90%以上的Ts-MT肽；Ts-MT肽和哌拉西林在摩尔比超过1：5时能形成肉眼可见白色沉淀，经超声后形成均匀的球状纳米颗粒，其粒径约为80 nm，分散性良好，zeta电位为-27.7 mV。所制备纳米颗粒具有明显的pH依赖的药物释放特性，在中性环境中相对稳定。体外抗菌实验显示抗菌纳米能显著提高哌拉西林对革兰氏阴性耐药细菌的抑菌效果，尤其是对表达广谱内酰胺酶的大肠杆菌效果最佳。研究进一步证明了抗菌纳米可以结合LPS，在和大肠杆菌细菌和HEK293细胞共孵育后可以选择性的结合到细菌表面。细胞毒性研究表明纳米颗粒没有明显的细胞抑制作用和溶血作用。在小鼠败血症模型中，和游离哌拉西林治疗组比较，靶向抗菌纳米能改善小鼠生存率和各项指标。体内毒性研究显示，靶向抗菌纳米在低中剂量组没有明显的毒副作用，但是在高剂量组显示有一定肝肾毒性，转氨酶AST和尿素氮明显升高。本研究设计并合成了一种新型的细菌靶向自组装纳米颗粒，研究结果显示靶向纳米颗粒具有良好的安全性和有效性，为临床细菌耐药性治疗提供一种新的解决思路。