东祁连山高寒草地禾草内生细菌的生物功能及机制研究

本项目利用微生物生态学传统技术和分子生物学研究手段相结合的试验方法，分离培养东祁连山高寒草地优势禾本科牧草内生细菌，测定其固氮、溶磷、产生吲哚乙酸和抑菌等功能，明确其功能多样性；对具良好生物功能的内生细菌，分别研究其固氮、溶磷和抑菌机制，且提取其基因组DNA，利用特异性引物扩增功能基因序列（如固氮基因(nifH)序列等），同时扩增16S rDNA序列并测序，明确其系统发育地位；通过模拟逆境条件（如寒冷、干旱和强紫外线等），测定接种内生细菌后禾草对矿质营养的吸收和利用能力、可溶性糖含量、叶绿素含量、光合速率、株高、分蘖能力、生物量、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶等指标，揭示内生细菌对禾草抗逆境能力的影响及机制。项目完成后不仅明确高寒草地禾草内生细菌的生物功能多样性和对禾草抗逆境能力的影响及机制，而且为阐明禾草内生细菌在高寒草地生态系统中的生态服务功能和评价进一步开发利用潜力提供依据。

定殖于宿主体内的内生细菌通过其生物功能（固氮、溶磷、产IAA和抑菌等）促进宿主生长和提高其忍耐逆境的能力，已成为近年来研究热点。本项目利用微生物生态学传统技术和分子生物学研究手段相结合的试验方法，分离培养东祁连山高寒草地牧草内生细菌，利用16S rDNA基因序列分析技术明确其系统发育地位，并测定其固氮、溶磷、产生吲哚乙酸和抑菌等生物功能。结果表明：（1）从31份牧草根、叶及种子等样品中分离到198株内生细菌分离物，经对其中134株内生细菌的16SrDNA基因序列分析，将其鉴定为24个属，且芽孢杆菌属为绝对优势种类。在GenBank中的登录号分别为KF818620~KF818660、KF954551~KF954553、KF811041-KF811050、KF836514-KF836543、KF831363- KF831412和KF939126-KF939132。（2）多株内生细菌对马铃薯坏疽病菌、马铃薯枯萎病菌（Fusarium avenaceum）及马铃薯炭疽病菌、萎蔫短小杆菌（C. flaccumfaciens）和丁香假单胞杆菌.、禾草叶枯病菌（Peyronellaea glomerata）和马铃薯干腐病菌（F. oxysporum）具有良好的抑菌作用；同时对优良菌株的抑菌机制、发酵条件、荧光标记、定殖动态及对土著微生物的影响等进行了研究；固氮、溶解无机磷、溶解有机磷和分泌IAA（大于10mg/L）的内生细菌分别占总内生细菌的63.1%、35%、31%和55.4%。（3）带内生细菌（E＋）植株的生物量、株高、分蘖能力、净光合速率和叶绿素相对含量均高于不带内生细菌（E－）植株，蒸腾速率E－植株高于E＋植株。在紫花针茅E－种群接种265ZY5后，E＋植株的株高和叶宽增长率高于E－植株；在逆境胁迫下叶绿素相对含量和可溶性蛋白E－植株下降幅度高于E＋植株，且叶绿素相对含量差异显著；在高温和低温胁迫下，可溶性糖E－植株上升幅度显著高于E＋植株，超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性E＋植株下降幅度显著低于E－植株。该结果表明，东祁连山高寒草地牧草内生细菌具有丰富的种类和功能多样性，且通过其生物功能提高宿主忍耐逆境的能力，初步明确了牧草内生细菌在高寒草地生态系统中的生态服务功能；所分离大量多功能内生细菌及培养条件的优化等研究为进一步开发利用高寒极端生境微生物资源奠定了基础。