烟粉虱与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）互作的机理研究

由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）是新传入我国的一种番茄病毒病。近二、三年来，该病害在我国从南至北迅速蔓延，在华南、华中、华北和西南的许多地区流行并造成了巨大的经济损失。本项目以入侵性强、危害严重的B型、Q型烟粉虱传播TYLCV为立项基础，研究B型、Q型和土著非B型烟粉虱种群对番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）获毒和传毒能力的差异，采用RNAi技术沉默B型烟粉虱体内传毒相关蛋白GroEL后，烟粉虱传毒能力的变化，进一步明确GroEL基因在烟粉虱传播病毒中的作用；把GroEL基因在pET原核表达载体系统中表达并进行蛋白纯化，采用凝胶覆盖试验研究TYLCV病毒粒子与GroEL蛋白的结合区域及关键结合位点。研究结果对于进一步揭示TYLCV病毒与B型烟粉虱之间的互作机制奠定基础，为防治该"超级害虫"提供理论依据。

烟粉虱是农作物及园艺作物上的一种重大外来入侵性害虫。目前认为烟粉虱是一种包括至少30多个生物型的复合种，在我国危害最严重的生物型是B型和Q型。烟粉虱除了成若虫刺吸叶片进行危害外，其成虫传播病毒病造成的危害为全球番茄生产带来巨大的经济损失。本项目立足于此，按照项目任务书完成了各项工作。首先研究了B型和Q型烟粉虱在国内的分布及田间种群携带的双生病毒TYLCV的情况，在本项目研究期间，Q型烟粉虱快速取代了B型烟粉虱成为我国大部分地区的主要危害生物型，田间Q型烟粉虱携带双生病毒TYLCV的比率显著高于B型；克隆了华北地区烟粉虱传播的双生病毒TYLCV的序列，通过系统进化分析其可能的来源；通过qPCR研究发现Q型烟粉虱在带毒寄主上取食12h即可达到了饱和量，比B型烟粉虱显著提早了12h。随后克隆获得了B型和Q型烟粉虱体内由次生内共生编码的传毒相关蛋白GroEL序列，结果表明该GroEL基因高度保守，全长1668bp个核苷酸，编码555个氨基酸。发现该蛋白与烟粉虱Hamiltonella分泌的GroEL序列同源性最高（99.96%），两个生物型之间有一个点突变存在，Q型烟粉虱GroEL的表达量显著高于B型（1.28倍），而且带毒之后GroEL的基因表达量显著升高；采用RNAi技术干扰了烟粉虱伪蛹中的GroEL基因，发现羽化后48小时该基因的表达量下降到原始表达量的69%，达到良好的沉默效果；明确了沉默后烟粉虱成虫的获毒能力显著下降，传毒能力有一定降低，说明烟粉虱传播双生病毒可能与GroEL有密切的内在联系。最后将烟粉虱的GroEL基因导入pet-28a原核表达载体上，通过优化其表达条件，通过Western Blotting表明成功得到了表达；对GroEL融合蛋白进行定点突变，获得了1个突变体，但未发现病毒与GroEL融合蛋白或其突变体之间在体外成功结合，说明尚需进一步优化其体外结合条件及相关试验。研究结果为进一步明确传毒蛋白在烟粉虱传毒过程中的作用及探寻其与病毒的结合特性及结合区奠定了坚实的基础。