MFSD2a泛素化在脑出血血脑屏障损伤中作用和机制研究

The injury of the blood-brain barrier (BBB) is a key factor in the neurological deficit after Intracerebral Hemorrhage (ICH). MFSD2a in brain endothelial cells plays primary role in the maintenance of BBB function. Our researchers found that MFSD2a is an important protective factor in ICH induced BBB damage. Its protein level decreased dramatically in ICH but its precise regulation mechanism was still unclear. Our preliminary experiments found that, the protein level of MFSD2a in the perihematomal brain tissue decreased but its mRNA increased significantly, suggesting that the decrease of MFSD2a might be regulated by alternative mechanisms other than the transcriptional change. Furthermore, it was found that lysosome inhibitor could block the decrease of MFSD2a protein, and there was significant ubiquitination of MFSD2a, which highly suggested that MFSD2a might be regulated by ubiquitination degradation. So We hypothesize that ICH can accelerate the ubiquitination degradation of MFSD2a, which results in the deterioration of BBB injury. In this study, we intend to use ICH model, combining with IP, LS-MS/MS, et al, to identify the pivotal molecule that induces the ubiquitination of MFSD2a and evaluate its therapeutic potentials on ICH. This project can not only reveal the new mechanism of MFSD2a ubiquitination degradation, but also provide new strategy and target for the treatment of ICH.

血脑屏障（BBB）损害是导致脑出血（ICH）后神经功能缺损的重要因素。脑内皮细胞特异性表达的MFSD2a是BBB功能维持的关键因子。我们前期研究发现，MFSD2a是ICH后BBB损伤的重要保护因子，在ICH中显著降低，但其调控机制尚不清楚。我们预实验发现ICH后MFSD2a蛋白水平下降但mRNA却显著增多，提示MFSD2a的减少由转录水平以外机制介导。进一步预实验发现溶酶体抑制剂可阻断MFSD2a蛋白下降，且MFSD2a存在显著的泛素化，强烈提示MFSD2a存在泛素化降解的调控机制。由此我们推测：ICH后内皮细胞MFSD2a泛素化降解增多，导致了BBB损伤。本项目拟采用ICH模型，利用免疫沉淀、液相色谱-串联质谱等方法，解析ICH后MFSD2a泛素化降解的关键分子机制，并探讨干预该机制对ICH的治疗效果。本研究不仅可揭示MFSD2a泛素化调控的新机制，还为ICH的治疗提供新思路。

脑内皮细胞特异性表达的MFSD2a是血脑屏障（BBB）功能维持的关键因子，MFSD2a的显著降低是脑出血（ICH）后血脑屏障损害的重要因素。既往研究发现，ICH后MFSD2a蛋白下降但mRNA却呈上升趋势，提示ICH后MFSD2a存在转录以外的调控机制，并在ICH中发挥重要调控作用。本项目从MFSD2a的降解机制为主要突破点，采用免疫沉淀、液相色谱-串联质谱、同源建模和动力学计算等方法，解析ICH后MFSD2a降解的关键通路及内在分子机制，并寻找潜在的干预药物。. 本项目结果发现ICH后MFSD2a的mRNA水平呈上升趋势，但其蛋白水平较sham组下降42.7%。蛋白稳定性实验提示溶酶体抑制剂氯喹并不能抑制Mfsd2a降解，但蛋白酶体抑制剂MG-132可稳定MFSD2a蛋白水平。泛素化实验提示MFSD2a存在显著的泛素化修饰，CO-IP联合LC-MS/MS质谱提示SYN1可能是其特异性E3泛素连接酶。通过同源建模和动力学计算发现了一段含赖氨酸的多肽，可能通过竞争抑制性抑制MFSD2a与E3泛素连接酶结合，导致MFSD2a被泛素标记减少而发挥抑制泛素化作用。综上，本项目研究提示MFSD2a存在显著泛素化修饰并主要经泛素-蛋白酶体途径降解，SYN-1是其特异性E3泛素连接酶，同时本研究开发了一种具有抑制MFSD2a泛素化的多肽，可望为脑出血BBB损伤的保护提供新的治疗策略。. 此外，在本项目的资助下，我们对脑出血后MFSD2a下游靶分子进行初筛。结果发现，EPA来源的5-HEPE、12-HEPE、15-HEPE、18-HEPE及DHA来源的16,17-EpDPE在脑出血后升高显著，有望为下一步MFSD2a下游靶分子的研究奠定基础。同时，在本项目的支持下，我们对梗死后脑出血的研究发现：1）静脉溶栓并不增强急性前循环颅内大血管闭塞血管内治疗后脑出血转化的风险。2）随血管内治疗时间的延迟，急性基底动脉闭塞症状性颅内出血的比例基本不变。3）替罗非班治疗与任何颅内出血风险增加有关，但不增加症状性颅内出血风险。4）RESCUE BT亚组分析显示，年龄大于67周岁、NIHSS大于16分以及心源性卒中患者使用替罗非班治疗时，症状性颅内出血风险更高。