3D仿生支架复合外周血干细胞构建组织工程半月板的实验研究

Meniscal tear is a common sports injury, which could lead to cartilage degeneration and osteoarthritis in an early stage. Tissue engineering meniscus is available for repair and replacement. As the most difficult issue, meniscus is heterogeneous structure (various regions own different cells, matrix and biomechanical properties), which have mainly effect on function. In our previous study, we found that polycaprolactone (PCL) scaffolds with various pore sizes owned different mechanical properties, and mesenchymal stem cells could be induced to different cell phenotype in various mechanical stimuli models. Therefore, to simulate the heterogeneous structure of meniscus, this study will fabricate bionic 3D PCL scaffold with gradient pore size firstly. Then peripheral blood mesenchymal stem cells are seeded and induced by TGF-β3 and CTGF. Thirdly, seed cells in various regions are stimulated in diverse mechanical models to induce into different fibrocartilage cell phenotype. Finally, the construction is transplanted in knee. Analyzing the cell morphology, gene expression, matrix secretion and biomechanical properties in vitro and prognosis in vivo. This study is hopefully to construct TEM with heterogeneous structure by modulating gradient pore size of scaffold and mechanical stimulation and have an insight on constructing TEM.

半月板撕裂是常见的运动损伤，可导致软骨退变和骨性关节炎过早发生。组织工程半月板（TEM）可用于它的修复和替代，但半月板不同区域的结构和力学强度存在差异，具备这种异质性结构的TEM才能起到缓冲膝关节应力的作用，有效替代缺失半月板。课题组前期实验表明，支架的孔径大小和应力刺激均可影响间充质干细胞（MSCs）的增殖分化。本课题拟采用熔融沉积技术制备具有梯度孔径的3D仿生聚己内酯（PCL）支架，复合外周血MSCs联合培养，用 TGF-β3和CTGF诱导后检测TEM不同区域的细胞表型；再模拟半月板体内受力环境，用自主研发的加压系统对TEM施加梯度应力刺激，检测TEM不同区域的细胞表型、基质成分和生物力学特性；最后将TEM植入体内，观察其转归。本课题旨在通过体内外实验探索TEM支架孔径和应力刺激的梯度分布对MSCs差异性分化的调控作用，并以此构建出半月板的异质性结构，为TEM的构建提供新的模式和思路。

天然半月板的前角、后角和体部及滑膜缘和游离缘除了形态和尺寸的差异外，各部位还具有细胞和基质、结构和功能的区域差异性。这被称为天然半月板组织的细胞和基质、结构和功能的异质性。虽然组织工程半月板的构建方法很多，但构建出和天然半月板类似的异质性半月板的方案还鲜有报道。本研究结合三维（Three dimensional，3D）打印技术及动态应力加压系统，探索了构建具有异质性结构的组织工程半月板方案。首先通过热熔融沉积成型（Fused Deposition Modeling，FDM）3D 打印技术打印出三种不同平均孔径的聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）支架，体外实验通过将MSCs种植后并进行成软骨诱导，验证支架的不同孔径对细胞粘附、增殖、细胞外基质诱导再生和分布的影响，并检测其生物力学强度（拉伸和压缩试验），体内试验将三种不同孔径的空白支架移植入兔膝关节内，并以内侧半月板全切为对照组，分析各组半月板再生情况和软骨退变情况，最终证实3D打印的PCL支架的内部孔径大小可以影响种子细胞的生物学功能，细胞外基质的产生以及最终的生物力学性能。平均孔径为215 μm的PCL支架兼具较理想的生物活性和生物力学性能，更加适用于组织工程半月板的构建。同时，我们通过动态应力加压系统和结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）/转化生长因子（Transforming Growth Factor，TGF-β3）对MSCs复合PCL支架的组织工程半月板进行体外调控培养，然后将调控后的组织工程半月板植入兔膝关节内替代切除的内侧半月板。一段时间后分别对新生半月板组织和关节软骨进行大体和组织学评估，并检测新生半月板组织拉伸和压缩的生物力学强度，结果显示动态应力加压系统和CTGF/TGF-β3双刺激诱导PCL上的干细胞区域性诱导分化，构建出异质性的组织工程半月板，其在关节软骨的保护作用上接近于正常半月板。因此，本研究为进一步实现个性化支架应用于部分或完全半月板移植替换提供了新思路，同时也为构建具有异质性结构的组织（如半月板、椎间盘、颞下颌关节盘）等提供新的方向。