瑞氏木霉内质网相关蛋白降解途径（ERAD）在蛋白合成分泌中的调控机理

Production and secretion of large amounts of cellulases characterizes the filamentous fungus Trichoderma reesei and therefore deserves a lot of attention by the industry. However, the production of heterologous proteins in T. reesei is always not efficient, leading to the limited application of this fungus for biotechnology market. The endoplasmic reticulum (ER) is the most important compartment for protein synthesis and secretion, so understanding the detailed regulation mechanism of ER associated degradation (ERAD) in protein synthesis and secretion in T. reesei would definitely provide new insights into this essential biological phenomenon and also contribute to the genetic modification for efficient production of heterologous proteins. This project will first explore the T. reesei genome sequence data, combined with homology alignment analysis, to retrieve the complete possible components of ERAD and make the potential networks of the pathway. A novel efficient gene-targeting approach aiming at multiple rounds of gene deletions will be developed and used to produce different deletion strains of the ERAD pathway. At the same time, the protein models for studying ERAD pathway will be developed, including the endogenous protein mutant and heterologous proteins. Technologies of cycloheximide chase, fluorescence localization and co-immunoprecipitation will be applied to studying the detailed function of the members of this pathway and the relationship between them, thus elucidating the regulation mechanism of ERAD pathway in protein synthesis and secretion. In addition, genetic engineering strategies will be implemented to improve the capacity of protein secretion in T. reesei, which would contribute to the high-efficient production of heterologous proteins for industrial application.

大量合成分泌纤维素酶的能力是丝状真菌瑞氏木霉的重要生物学特性，也是其用于工业生产的价值所在。但当表达异源蛋白时产量往往很低，这已成为限制其工业化应用的瓶颈。内质网是蛋白合成分泌的首要场所，深入阐明瑞氏木霉内质网相关蛋白降解途径（ERAD）的调控机理不仅有助于理解蛋白分选降解这一重要生物学现象，也有助于实现异源蛋白的高效生产。本研究首先利用基因组数据结合同源比对分析理清ERAD途径相关组分成员；利用高效基因敲除体系构建ERAD系列基因敲除株；同时，建立起内源与异源不同类别蛋白表达模型；利用蛋白追踪定位结合免疫沉淀等策略系统研究鉴定ERAD成员功能及之间相互关系，并系统分析该途径对蛋白分泌过程的调控作用，从而深入阐释ERAD途径对蛋白合成分泌的调控机理；提出提高蛋白分泌效率的遗传工程策略，并构建瑞氏木霉高蛋白分泌水平的菌株，为进一步构建高效表达异源蛋白工程菌奠定基础。

瑞氏木霉（又称“里氏木霉”）是大量合成分泌纤维素酶的丝状真菌，但当表达异源蛋白时产量往往很低，这已成为限制其工业化应用的瓶颈。深入阐明瑞氏木霉内质网相关蛋白降解途径（ERAD）的调控机理不仅有助于理解蛋白分选降解这一重要生物学现象，也有助于实现目标蛋白的高效生产。项目取得的主要成果如下：（1）利用基因组数据结合同源比对分析全面梳理了真核生物特别是丝状真菌内质网蛋白折叠运输与ERAD途径，并分析了ERAD途径的关键组分成员的潜在改良靶点，尤其是对瑞氏木霉分泌纤维素酶及其遗传改良前景进行了系统分析与总结。（2）建立起瑞氏木霉基于营养缺陷与抗性筛选结合的高效基因敲除体系，以β-葡萄糖苷酶BGL1蛋白的超高水平表达研究了蛋白分泌潜力，进一步构建了ERAD关键组分OS9、Hrd1、Hrd3和Der1编码基因敲除株，发现OS9对外切纤维素酶（CBH）和BGL分泌具有重要作用，而Hrd1、Hrd3及Der1对内置网分泌压力具有重要作用，其中Hrd1的作用更加显著。（3）建立起Lac1、EGFP等蛋白表达体系，发现Lac1能够显著引起ERAD响应，而当敲除内源主要蛋白CBH1后成功分泌Lac1并且降低ERAD响应，而EGFP蛋白的表达基本不影响蛋白分泌压力。（4）系统研究鉴定 ERAD 成员功能及之间相互关系，证明内质网膜蛋白组分Hrd1是核心成员，其功能负责了不同蛋白降解效率，而Der1和Hrd3相互作用辅助蛋白运输到Hrd1进行跨膜转运会细胞质，同时发现ERAD途径有助于菌株在分泌压力下的细胞正常生长。（5）利用遗传工程策略建立起瑞氏木霉表达CBH1、EG2和BGL1三种蛋白的高水平分泌菌株，实现了纤维素酶系的优化并用于纤维素糖化应用。本项目根据研究目标与计划不断深入开展系统研究，分析了瑞氏木霉ERAD途径对蛋白分泌过程的调控作用，深入阐释了 ERAD 不同组分成员在蛋白合成分泌中的具体机制，并构建起瑞氏木霉高蛋白分泌水平的菌株，为高效表达目标蛋白工程菌奠定基础。