意大利蜜蜂级型分化关键基因Dnmt3启动子的分析及其上游转录调控因子的鉴定

Dnmt3 is a key gene for honeybee caste differentiation. It regulates the caste differentiation of female honeybee by altering the DNA methylation state of its downstream target genes at the larvae stage. Our previous studies have found that the honeybee Dnmt3 gene exhibit differences in mRNA transcription between queen larvae and worker larvae during the critical period of larvae caste differentiation. However, the mechanism leading to this difference is unclear. This study was aimed to identify the critical transcriptional regulation regions of the honeybee (Apis mellifera ligustica) Dnmt3 promoter, identify transcription factors binding to the Dnmt3 promoter, and analyze the function of the identified transcription factors. Through these studies, we hope to clarify the regulation mechanism of honeybee Dnmt3 gene from the molecular level, and make the regulatory network of the honeybee caste differentiation become completed.

Dnmt3基因为调控蜜蜂级型分化的关键基因，在雌性蜜蜂幼虫期，它通过改变下游基因的DNA甲基化状态来调控雌性蜜蜂的级型分化。我们的前期研究表明 Dnmt3基因在蜂王幼虫和工蜂幼虫分化的关键时期存在mRNA转录差异，但是对于造成这种转录差异的调控机理还不清楚。本研究期望鉴定出蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Dnmt3基因启动子的关键转录调控区域，鉴定出结合在这些关键调控区域的转录因子，对这些转录因子进行功能分析。希望通过这些研究弄清蜜蜂Dnmt3基因受到转录调控的具体分子机理，完善蜜蜂级型分化调控网络。

Dnmt3基因为调控蜜蜂级型分化的关键基因。本研究对意大利蜜蜂Dnmt3基因转录起始位点进行了鉴定，发现意大利蜜蜂Dnmt3基因存在多个启动子，转录出多种mRNA剪切形式，编码不同的蛋白。共鉴定出5种不同的选择性剪切形式，分别命名为Amdnmt3-R1、-R2、-R3、-R4、-R5，mRNA 长度分别为3514 nt、3678 nt、2799 nt、2301 nt、2668 nt，编码1112 aa、1113 aa、916 aa、701 aa、808 aa。.双荧光素酶报告基因实验表明Amdnmt3的启动子在HEK293细胞中具有转录活性，且在该启动子序列上有多个SP1结合位点。我们对SP1基因在意大利蜜蜂中的同源基因Amsp4基因进行了克隆，Amsp4基因mRNA长为2614 nt，编码831 aa，C端具有3个C2H2锌指结构域。意大利蜜蜂SP4蛋白与人、小鼠、大鼠SP1蛋白的相似性分别为33.69%、33.10%、33.06%，在3个C2H2锌指结构域处的相似性均为93.98%。EMSA实验表明AmSP4蛋白能结合到Amdnmt3基因启动子上。对意大利蜜蜂幼虫中Amsp4进行RNAi之后Amdnmt3的表达量显著降低。荧光定量PCR结果表明：在48h，Amsp4基因在蜂王幼虫和工蜂幼虫间无显著表达差异；在84h，Amsp4基因在工蜂幼虫中的表达量显著高于蜂王幼虫（p<0.05）；在120h，Amsp4基因在蜂王幼虫中的表达量显著高于工蜂幼虫（p<0.05）。这说明Amsp4基因在蜂王和工蜂幼虫间的表达差异调控了Amdnmt3的表达。.本研究还对所有在西方蜜蜂蜂王幼虫和工蜂幼虫间有表达差异的转录因子进行了分析。发现有501个转录因子在蜂王幼虫和工蜂幼虫间有表达差异，其中，348个仅在蜂王幼虫中上调表达，90个仅在工蜂幼虫中上调表达，有63个在不同发育阶段的蜂王幼虫和工蜂幼虫间表现出不同的上调或下调趋势。