华西雨蛙皮肤神经毒结构与功能研究

在多种动物中已发现基因编码的神经毒，但还没在两栖动物中发现。最近，我们首次从华西雨蛙（Hyla annectans）皮肤中发现了基因编码的神经毒anntoxin （JBC,2009），不同于其它神经毒含有三个以上的二硫键，anntoxin仅含有二个二硫键，60个氨基酸，具典型的Kunitz分子构型，它对河豚毒素敏感的钠通道具有强烈的抑制作用，也体现强的丝氨酸蛋白酶抑制活性，为双功能多肽毒素。本项目拟在前期工作基础上，定点突变anntoxin关键结构域A位点和P位点，对这些分子突变体进行结构与功能研究，找到其结构和功能关键位点和氨基酸残基，识别该毒素发挥其双功能性能的结构功能关系及分子机制，为设计、利用高效、专一作用的钠通道毒素打下基础。

按照项目计划书，完成了相关研究工作。通过改变华西雨蛙皮肤中发现的神经毒素anntoxin A位点和P 位点的氨基酸残基组成，研究了各个位点对Anntoxin 高级结构和生物功能的作用。设计了anntoxin的P位点和A位点各5个单突变体，合成了cDNA序列，分别构建了重组表达质粒，得到10 个重组anntoxin （r-anntoxin1-10）。利用3D-NMR技术构建r-anntoxin1-10的3D-NMR溶液结构，并与anntoxin的3D-NMR溶液结构进行比较，考察了各个位点对anntoxin结构的影响。同时利用发色底物和胰蛋白酶检测了r-anntoxin1-10体外胰蛋白酶抑制剂活性。用膜片钳技术测试了r-anntoxin1-10对TTS-Nav的作用。为了研究各个位点对anntoxin体外生物活性的影响，进行动物急性毒性实验。以上这些研究为设计和利用高效、作用专一的钠通道毒素打下了基础。受该课题资助发表了5篇SCI收录研究论文（均标注了该课题号：31000962）。