YdiV促ClpXP蛋白酶降解FlhDC复合物的分子机制研究

ClpXP protease is an important regulatory protein of cellular activities by hydrolyzing many function proteins such as crucial transcription factors. The mechanism by which ClpXP protease recruits adaptors and recognizes substrates is a hot focus. Among them, An important phenomenon has recently been found that with the help of YdiV, ClpXP can regulate the motive behavior of bacteria by degrading flagellum biosynthesis master switch--FlhDC complex. But the molecular mechanism of this phenomenon has not been elucidated, which greatly restricts the research progress on bacterial behavior regulation of ClpXP. Our previous research has identified that YdiV, FlhD and ClpX interact with each other directly. In this project, we are going to determine the crystal structure of YdiV-ClpX and YdiV-FlhD-ClpX complex. Based on the structure of those complex, we will confirm the sites and types of protein-protein interact surface.Compared with the structures of ClpXP, YdiV and FlhDC in Protein Data Bank, we will analyze dynamic interaction of YdiV, ClpXP and FlhDC in this degradation process. Structural analysis combined with necessary biochemical and in vivo experiments will reveal the mechanism of this degradation process at the molecular level. This study will provide important data for the substrate recognition and binding mechanism of ClpXP protease, but also provides theoretical basis for the research of bacterial flagella regulation.

ClpXP蛋白酶是细胞生命活动的重要调控蛋白，其通过降解重要功能蛋白发挥作用。而ClpXP如何招募辅助因子发挥蛋白降解功能是国内外关注的热点。其中，YdiV蛋白协助ClpXP降解“鞭毛合成总开关”FlhDC复合体成为细菌运动行为调控的重要现象。但这一现象的分子机理还未被阐明，极大制约了ClpXP在细菌行为调控方面的研究进展。本课题组在前期确定YdiV、FlhD及ClpX亚基三者存在直接互作的基础上，拟通过测定YdiV-ClpX及YdiV-FlhD-ClpX的晶体结构，进一步将YdiV确定为ClpXP调控鞭毛的特异辅助因子。通过与已知结构的叠合、对比，清晰完整地描绘出底物识别和酶催化过程中蛋白间的动态互作与构形变化。并基于结构构建功能缺失突变体，比较野生型和突变体的酶活及细菌移动性，系统地阐述降解过程的分子机理。为ClpXP底物识别机制研究提供重要数据，也为细菌鞭毛调控提供了重要的理论基础。

鞭毛是细菌特有的运动器官。鞭毛的运动使细菌在复杂的自然环境中趋利避害。很多病原菌的鞭毛还与其致病能力密切相关。以往有研究表明细菌会根据所处环境适时改变其鞭毛的生长状态。但这些过程的分子机制并不明确。通过本项目的研究，我们系统地阐释了EAL-like蛋白家族成员YdiV与STM1697帮助沙门菌关闭鞭毛合成通路实现免疫逃逸的过程。具体进展如下：.1）揭示YdiV调控细菌鞭毛生长的新机制。我们在前期确定YdiV-FlhD相互作用的基础上（2012，NAR），首次确定YdiV、FlhD及ClpX亚基三者存在直接互作，并确定相互作用的具体位点为YdiV的C端2个氨基酸及70位的丝氨酸与ClpX ZBD 结构域。通过结构模拟建立了YdiV作为ClpXP蛋白酶的adaptor协助其降解FlhDC的机制模型。更有意思的是我们发现了YdiV调节ClpXP蛋白酶的活性受到蛋白修饰的调控，并进一步鉴定到调控这一过程的关键修饰酶YdiU，解析了YdiU的晶体结构，确定了YdiU的作用机制。.2）揭示STM1697调控沙门菌鞭毛生长及致病性的机制。我们发现当沙门菌进入到宿主细胞后，其STM1697蛋白的表达量显著上升（入侵8h后升高到入侵前的65.8倍）。更重要的是，将STM1697基因敲除后，沙门菌就丧失了感知宿主环境并抑制其鞭毛蛋白表达的能力。我们进一步研究确定STM1697是通过与鞭毛激活蛋白FlhDC相互作用来抑制鞭毛蛋白的表达。使用X-ray衍射法，解析STM1697-FlhD复合物2.0 Å高分辨率的晶体结构。通过结构分析结合体外生物化学实验，得出STM1697结合在鞭毛激活蛋白FlhDC外围，通过抑制RNA聚合酶的招募来阻碍鞭毛基因表达。通过比较野生型、STM1697敲除菌以及回补菌株的细胞侵染能力、免疫因子产生量和小鼠致病性等表型，研究完整地阐述了鼠伤寒沙门氏菌通过调节STM1697蛋白表达来关闭鞭毛表达进而调控致病性和实现免疫逃逸的分子机制。.通过本项目的研究不仅深入揭示了细菌鞭毛生长调控的分子机制还为沙门菌等胞内寄生细菌的致病机制研究提供重要数据，也为研制通过抑制鞭毛生长控制致病菌感染的新型抗生素提供了理论基础。