Rfx6通过IL6/Jak/STAT3信号通路调控肝细胞癌侵袭转移的机制研究

Regulatory factor x6 (Rfx6) was identified as a new member of Rfx family, and regulated the differentiation of pancreatic islet cell. The role of Rfx6 in human primary hepatocellular carcinoma (HCC） remains unclear. When compared with the matched non-cancerous liver tissues, the expression level of Rfx6 was higher in HCC tissues. Transwell assays showed that overexpression of Rfx6 significantly increased migration and invasion of HCC cells. In addition, we found that Rfx6 enhanced the expression of IL6 and phosphorylation of stat3 by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) sequence analysis, q-PCR, and western blotting. Therefore, we hypothesized that Rfx6/IL6/Jak/STAT3 pathway might play a role in promoting migration and invasion in HCC cells. Based on the above preliminary data, we will further explore the role of Rfx6 on HCC in more cell lines and animal model by overexpression and knockdown of Rfx6. Furthermore, ChIP-qPCR, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and luciferase assays were used to investigate the role of Rfx6 in IL6/Jak/STAT3 signaling pathway..This project will explore the function and mechanism of Rfx6 on metastasis of HCC and provide information of predicting the prognosis of HCC, guiding the targeted treatment, and preventing of recurrence and metastasis.

转录因子X6（Rfx6）与胰岛发育有着密切的关系，目前关于Rfx6在肿瘤中的作用仅限于前列腺癌且其作用机制尚不明确，Rfx6在肝癌中的研究至今未见报道。前期研究发现，Rfx6在肝癌组织中表达明显高于癌旁肝组织；体外过表达Rfx6能够促进肝癌细胞迁移和侵袭；ChIP-seq等实验发现Rfx6调控IL6，过表达Rfx6可上调肝癌细胞IL6表达、促进stat3磷酸化，我们推测Rfx6可能通过IL6/Jak/STAT3信号通路调控肝细胞癌侵袭转移。基于前期结果，本项目拟在细胞、动物模型和临床病例三个层面进一步阐述Rfx6在肝癌中的功能及表达调控机制。采用ChIP-qPCR、荧光素酶报告、EMSA、回补实验等方法，进一步证实Rfx6是否通过调控IL6表达影响IL6/Jak/STAT3信号通路从而促进肝癌侵袭转移，本课题旨在深入探索Rfx6促进肝癌细胞侵袭转移的机制，为寻找新的潜在分子靶点提供依据。

项目的背景：原发性肝癌是我国的主要癌种之一，严重威胁我国人民的生命健康。转录因子X6（Regulator factor X6, RFX6）对于胰岛的发育和成熟至关重要。基于TCGA数据库的分析，发现RFX6在肝癌中存在高表达。目前已有研究揭示RFX6与肿瘤的相关性，但RFX6在肝癌发生发展中扮演的角色与内在的分子机制仍未见报道。.主要研究内容：采用肝癌组织芯片检测RFX6在肝癌患者中的表达情况，并分析研究RFX6表达与肝癌患者临床病理特征以及患者生存预后的相关性；利用CCK-8、平板克隆形成和EDU实验，探讨RFX6对肝癌细胞体外增殖能力的影响；利用Trans-well实验来探讨RFX6对肝癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响；利用裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型，探讨RFX6对肝癌细胞体内增殖能力的影响；利用尾静脉肺转移模型，探讨RFX6对肝癌细胞体内转移能力的影响；利用ChIP和相关测序探索RFX6的潜在调控通路；利用代谢组学、糖酵解压力测试实验、线粒体压力测试来验证RFX6对肝癌细胞糖酵解和氧化磷酸化的影响；利用葡萄糖摄取实验与小动物PET-CT，验证RFX6对肝癌细胞体内外葡萄糖摄取能力的影响；利用生物信息学数据库预测RFX6与下游基因启动子的结合位点；利用ChIP和双荧光素酶报告基因实验鉴定RFX6转录调控的下游基因；利用糖酵解压力测试实验，证明RFX6促进肝癌细胞糖酵解的作用可以被抑制PGAM1的功能所逆转。.重要结果: RFX6在肝癌组织中表达上调，可以作为肝癌术后总生存期和无复发生存期的独立预测因子；RFX6可以通过调控PGAM1的表达，促进肝癌糖酵解，进而促进增殖和转移；RFX6/PGAM1有望成为肝癌治疗药物开发的新靶点。.关键数据：肝癌组织中RFX6的表达明显高于癌旁组织，RFX6高表达的肝癌患者术后总生存期和无复发生存期均显著劣于RFX6低表达组的患者，RFX6高表达是总生存期和无复发生存期的独立风险预测因子。RFX6可以促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭；RFX6的表达与肝癌细胞的糖代谢相关，过表达RFX6可以促进肝癌细胞的糖酵解与葡萄糖摄取，抑制肝癌细胞的氧化磷酸化；RFX6可以正向调控PGAM1的表达，并依赖PGAM1的表达上调实现对肝癌细胞增殖、侵袭转移的促进作用；干扰PGAM1的表达，可以逆转RFX6对肝癌细胞增殖、侵袭转移的促进作用。