三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)硫酯酶基因在脂肪酸合成中的功能分析

硫酯酶(thioesterase)是微藻脂肪酸合成途径中一个重要的酶。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)基因组编码两个硫酯酶，在氨基酸序列上它们与植物硫酯酶没有同源性。通过前期的研究我们发现一个预测的硫酯酶(PtTE1)对C18:1表现出较高的底物特异性，在三角褐指藻中过表达该基因并没有明显改变细胞脂肪酸组成，但是总脂肪酸合成量提高了72%。本项目通过异源表达硫酯酶基因和体外生化实验进一步确定这两个硫酯酶的底物特异性；采用硫酯酶信号肽与绿色荧光蛋白(GFP)融合的方法对硫酯酶进行亚细胞定位；通过过量表达硫酯酶基因并利用硫酯酶基因的反义序列和反向重复序列构建基因敲降突变株，采用薄层层析(TLC)和气质联用(GC-MS)分析揭示突变株各酰基脂类中脂肪酸组成和含量的变化规律，初步阐明硫酯酶在三角褐指藻脂肪酸合成中的功能。

三角褐指藻基因组编码两个硫酯酶，分别注释为硫酯酶Pttes1和棕榈酰蛋白硫酯酶Pttes2。本项目主要是研究三角褐指藻中这两个硫酯酶在脂肪酸合成中的功能。生物信息学分析表明Pttes1预测的蛋白属于HotDog超家族成员， 而Pttes2属于棕榈酰蛋白硫酯酶(palmitoyl-protein thioesterase)家族。为了证明这两个预测的硫酯酶是否具有水解硫酯的活性，将这两个硫酯酶基因全长编码区分别克隆到pUC18载体并置于lac启动子控制之下，在大肠杆菌突变株E.coli fadD88中进行表达并涂布添加中性红染料的平板，菌体颜色变化的结果表明Pttes1具有水解硫酯释放游离脂肪酸的活性而Pttes2没有该活性。在氮源充足条件下，Pttes1和Pttes2基因表达模式不同，而在缺氮培养过程中Pttes1表达逐步上调。Pttes1分别在大肠杆菌XL1-Blue 和 K27fadD88中进行异源表达，通过分析膜脂和培养基上清中脂肪酸组成来分析Pttes1蛋白底物特异性。重组Pttes1可以将E.coli XL1-Blue膜脂脂肪酸含量提高21%，并且明显改变了膜脂和培养基中分泌脂肪酸的组成，这些变化表明重组Pttes1对C18:0和C18:1脂肪酸具有较高酶活性。在三角褐指藻中过表达Pttes1不能明显改变脂肪酸组成，但是总脂肪酸含量提高了72%。过表达或RNAi藻株中极性脂和非极性脂类中脂肪酸组成的变化将采用单双向薄层层析结合气相色谱进行分析。